益氣活血安神法通過抑制鈣超載減大鼠心肌缺血再灌注損傷的實驗研究.pdf

1、再灌注治療是冠心病急性心肌梗死(AMI)治療史上里程碑式的進展，其手段主要有三種:靜脈溶栓、經(jīng)皮冠狀動脈腔內(nèi)成形及支架植入術(shù)(PTCA+PCI)、冠脈旁路移植術(shù)(CABG)，隨著介入器械和技術(shù)的日臻成熟，PCI已成為治療冠心病AMI的主要手段。
　　但是，再灌注治療只是一種局部治療手段，并不能終止冠心病的病理發(fā)展進程，加之治療后出現(xiàn)的一系列心肌缺血再灌注損傷（MIRI），嚴重制約了冠心病的治療效果。在MIRI過程中炎癥反應(yīng)、氧化損

2、傷、鈣超載及能量利用障礙等都發(fā)揮著重要作用，其中鈣超載是造成心肌細胞損傷和死亡的共同通路，故防治鈣超載是減輕MIRI的重要舉措。目前針對MIRI的西醫(yī)干預(yù)多限于實驗研究，很多藥物尚未應(yīng)用于臨床，只有苯磺酸氨氯地平防治其他器官（如肝臟、卵巢）再灌注治療后鈣超載的實驗報道。但由于苯磺酸氨氯地平是通過作用于血管平滑肌的L型Ca通道從而抑制鈣超載，存在作用靶點單一、可明顯抑制心肌細胞收縮功能，副作用較大，故臨床應(yīng)用有一定局限性。中藥也有鈣拮抗作

3、用，但其具體作用特點及機制與臨床常用有效西藥鈣通道阻滯劑苯磺酸氨氯地平（絡(luò)活喜）的異同未見報道。
　　基于心肌缺血再灌注損傷的中醫(yī)病因病機，結(jié)合多年臨床經(jīng)驗導(dǎo)師創(chuàng)制出益氣活血復(fù)方（以下簡稱復(fù)方），功在益氣活血，涼血安神，其主要組成為黃芪、丹參、三七、銀杏、酸棗仁等提取物。圍繞“防治鈣超載”和“保護心功能抑制心室重構(gòu)”這兩大目標，進行益氣活血復(fù)方對心肌缺血再灌注大鼠心肌損傷保護作用及機制的研究，擬為益氣活血復(fù)方防治MIRI特色和優(yōu)勢

4、分析提供實驗依據(jù)。
　　目的：
　　觀察益氣活血復(fù)方對心肌缺血再灌注損傷大鼠心室早期重構(gòu)、心臟射血分數(shù)、和心肌梗死區(qū)/缺血區(qū)比例的影響;并從miRNA-133調(diào)控鈣超載及細胞凋亡角度探討益氣活血復(fù)方的作用機制。
　　方法：
　　225只雄性Wistar大鼠，體重為300±20g，隨機分為假手術(shù)組、模型組、絡(luò)活喜組、益氣活血復(fù)方高、中、低劑量6組，預(yù)防性給藥7天后，結(jié)扎大鼠心臟冠脈左前降支，50min后復(fù)灌，制作大

5、鼠心肌缺血再灌注損傷模型。分別于造模前、造模后及復(fù)灌48h行心臟射血分數(shù)及心室內(nèi)徑檢測，后處死大鼠，取血，離心取血清，剪取心臟，以依文思藍-TTC雙染色評估心肌梗死區(qū)與缺血區(qū)面積百分比，據(jù)此選擇益氣活血復(fù)方最優(yōu)劑量進行后續(xù)機制探討。每組取6只大鼠，行HE染色及TUNEL染色，取缺血區(qū)心肌組織，比色法檢測心肌鈣離子含量，Western blot法檢測左心室缺血區(qū)心肌組織SERCA、CasR、MAPK通路、CytC、Caspase-3及Bc

6、l-2蛋白的表達，Real-Time PCR法檢測大鼠左心室缺血區(qū)心肌組織miRNA-133的表達。
　　結(jié)果：
　　(1)心臟EF值:①造模術(shù)后:與假手術(shù)組相比，其余5組EF值均有不同程度的降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);余各組間無差異。②復(fù)灌48h-模型組較造模術(shù)后EF值明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），余各組均有不同程度升高，但較造模術(shù)后無差異。③復(fù)灌48h-與假手術(shù)組相比，各組心臟EF值均有顯著

7、下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）;與模型組相比，益氣活血復(fù)方高、中、低劑量組均能顯著提高EF值，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但三者之間無差異;絡(luò)活喜組與模型組無明顯差異。
　　(2)LVIDd及LVIDs:①LVIDd:與假手術(shù)組相比，模型與低劑量組LVIDd明顯增大，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）;余各組與假手術(shù)無明顯差異。與模型組相比，高劑量組LVIDd顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);余絡(luò)

8、活喜、中劑量及低劑量與模型組無差異。②LVIDs:與假手術(shù)組相比，模型組LVIDs顯著增大，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）;余各組間無明顯差異。與模型組相比，高劑量及中劑量組LVIDs顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），但二者之間無差異。
　　(3)心肌梗死/缺血區(qū)比率（梗死區(qū)/缺血區(qū)比率大于30％小于60％）:與模型組相比，絡(luò)活喜及高劑量組均能顯著減小心肌梗死/缺血區(qū)比率，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）;但絡(luò)活

9、喜及高劑量兩組間無明顯差異。
　　(4)心肌組織鈣含量:與假手術(shù)組相比，模型組鈣離子顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）;絡(luò)活喜及高劑量組含量顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，但絡(luò)活喜及高劑量二者組間無明顯差異。
　　(5)對SERCA2A及CasR表達的影響:①SERCA2A:與假手術(shù)相比，模型組心肌SERCA2A表達水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）;與模型組相比，絡(luò)活喜和高劑量組表達水

10、平均顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），但絡(luò)活喜和高劑量組間無明顯差異。②CasR:與假手術(shù)組相比，模型、絡(luò)活喜及高劑量組CasR表達水平顯著升高，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);與模型組相比，高劑量組顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);高劑量與絡(luò)活喜組相比，心肌CasR表達水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　(6)心肌細胞凋亡檢測:與假手術(shù)相比，各組心肌凋亡指數(shù)均有顯著升高，差異具

11、有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);與模型組相比，絡(luò)活喜及高劑量均能顯著降低心肌凋亡指數(shù)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，但二者組間無明顯差異。
　　(7)對CytC、Caspase-3及Bcl-2表達的影響:①CytC:與假手術(shù)相比，模型及高劑量組心肌CytC表達均有明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);絡(luò)活喜與假手術(shù)之間無明顯差異;與模型組相比，絡(luò)活喜及高劑量組均有明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，但絡(luò)活喜與

12、高劑量組間無明顯差異。②CasPase-3:與假手術(shù)相比，模型、絡(luò)活喜及高劑量組CasPase-3表達均有明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）;與模型組相比，絡(luò)活喜及高劑量組均有明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，但絡(luò)活喜與高劑量組間無明顯差異。③Bcl-2:與假手術(shù)相比，模型和絡(luò)活喜組均有明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），高劑量與假手術(shù)組間無差異;與模型組相比，絡(luò)活喜和高劑量組均有明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)

13、意義(P＜0.01);與絡(luò)活喜組相比，高劑量組顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　(8)對P38、JNK、ERK1/2表達的影響:①P38:與假手術(shù)相比，模型、絡(luò)活喜及高劑量組P38表達水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);與模型組相比，絡(luò)活喜和高劑量組顯明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）;絡(luò)活喜與高劑量組間無明顯差異。②JNK:與假手術(shù)組相比，模型組表達水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜

14、0.05）;余各組間無明顯差異。③ERK1/2:與假手術(shù)相比，模型、絡(luò)活喜及高劑量組ERK1/2表達水平均有明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）;與模型組相比，絡(luò)活喜組顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);與絡(luò)活喜組相比，高劑量組明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　(9)對miRNA-133表達的影響:與模型組相比，假手術(shù)、絡(luò)活喜及高劑量組miRNA-133表達明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.

15、01）;與假手術(shù)相比，絡(luò)活喜及高劑量組無明顯差異;絡(luò)活喜與高劑量組之間無明顯差異。
　　結(jié)論：
　　(1)益氣活血復(fù)方和絡(luò)活喜均可減小大鼠心肌缺血再灌注損傷時心肌梗死面積;此外益氣活血復(fù)方還能提高再灌注引起的心臟EF值降低、抑制LVIDd、LVIDs的增大，從而抑制MIRI早期左心室的惡性重構(gòu)，改善心功能，其綜合效應(yīng)明顯優(yōu)于絡(luò)活喜。
　　(2)益氣活血復(fù)方能抑制心肌缺血再灌注損傷鈣超載，并減輕鈣超載引起的線粒體途徑的心