豬胚胎來源干細胞建系方法的初步研究.pdf

1、哺乳動物胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESC）和滋養(yǎng)層干細胞(trophoblast stem cells，TSC)均屬于胚胎來源的干細胞，由早期胚胎或內細胞團(inner cell mass，ICM)培養(yǎng)而來。胚胎干細胞已經(jīng)在小鼠、人、猴子和大鼠上成功建系，滋養(yǎng)層干細胞也已經(jīng)在小鼠、人、兔子和猴上成功建立。但無論是胚胎干細胞還是滋養(yǎng)層干細胞，在有蹄類大動物上均未取得成功。由于豬在體型和相關生理功能方面都與人類十

2、分接近，所以豬胚胎干細胞和滋養(yǎng)層干細胞是研究人類相關基因疾病以及異種移植的最佳模型。本研究初步摸索豬滋養(yǎng)層干細胞的建系方法;同時構建高表達白血病抑制因子(leukemia inhibitor factors，LIF)的飼養(yǎng)層細胞，并構建豬源轉錄因子表達載體，以期提高豬胚胎干細胞的質量及建系效率。
　　目的:
　　通過接種體外受精囊胚，建立豬滋養(yǎng)層干細胞系;建立高效表達豬LIF的STO細胞系，優(yōu)化豬胚胎干細胞的培養(yǎng)條件;構建豬

3、源轉錄因子表達載體，輔助豬胚胎干細胞建系。
　　方法:
　　1.通過接種體外受精囊胚，建立豬滋養(yǎng)層干細胞系:通過體外受精和發(fā)育培養(yǎng)獲得第6天囊胚，去除透明帶后將全胚接種于STO飼養(yǎng)層上，用FGF系統(tǒng)干細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)滋養(yǎng)層干細胞，并利用機械切割的方法進行傳代，通過形態(tài)學和堿性磷酸酶染色方法鑒定其干細胞特性。
　　2.通過脂質體轉染的技術，將已構建的豬LIF基因真核表達載體pCAG-pLIF轉染至小鼠STO細胞中，通過藥物

4、篩選獲得能夠穩(wěn)定表達豬LIF的轉基因STO細胞（STO-pLIF細胞）。通過QPCR、Western blot等方法檢測STO-pLIF細胞中豬LIF的表達量。選擇高效表達豬LIF的STO-pLIF細胞作為飼養(yǎng)層，培養(yǎng)大鼠誘導多能性干細胞(induced pluripotency stem cells，iPS)。通過生長曲線檢測、堿性磷酸酶染色、干細胞多能因子的RT-PCR檢測和免疫熒光染色等方法，檢驗STO-pLIF細胞飼養(yǎng)層在大鼠i

5、PS細胞培養(yǎng)方面的功能。
　　3.以豬胚胎成纖維細胞(pig embryonic fibroblast，PEF)的eDNA為模板，合成或擴增豬源OCT4、TBX3、REX1、LIN28、DPPA5五個轉錄因子，利用PCR方法，將REX1、LIN28、DPPA5以E2A和T2A序列連接成3因子片段并通過測序檢測其準確性，將商業(yè)構建的OCT4和TBX3以及自行構建的三因子片段分別經(jīng)過限制性內切酶酶切后連接到誘導表達載體pTRE3G-Z

6、sGreenI中，獲得三個重組表達載體。為了驗證所構建質粒功能，將豬源OCT4重組表達載體和pEFla-Tet3G質粒共轉入PEF細胞中，并在細胞培養(yǎng)時添加強力霉素(DOX)誘導外源轉錄因子表達，通過QPCR檢測載體中豬源OCT4的表達情況。
　　結果:
　　1.所建立的滋養(yǎng)層干細胞系最高傳代至第9代，逐漸出現(xiàn)較多油滴，無法繼續(xù)傳代;由于傳代受限，無法有效擴增細胞系，后續(xù)的核型鑒定和堿性磷酸酶染色結果均不理想。
　　2

7、.獲得豬LIF轉基因陽性STO細胞系，STO-pLIF細胞中LIF基因和蛋白的表達量均有上調;該細胞系作為飼養(yǎng)層所培養(yǎng)的大鼠iPS細胞在形態(tài)、多能性因子表達方面更接近于含LIF的傳統(tǒng)培養(yǎng)液培養(yǎng)的大鼠iPS細胞，顯著優(yōu)于無外源LIF添加的培養(yǎng)液所培養(yǎng)的大鼠iPS細胞。
　　3.成功構建豬源轉錄因子重組表達載體，在豬源OCT4重組表達載體與pEF1a-Tet3G質粒共轉PEF細胞并經(jīng)DOX誘導表達后，利用QPCR檢測發(fā)現(xiàn)其有效提高了P