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文檔簡介
1、哺乳動物胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells,ESC)和滋養(yǎng)層干細(xì)胞(trophoblast stem cells,TSC)均屬于胚胎來源的干細(xì)胞,由早期胚胎或內(nèi)細(xì)胞團(inner cell mass,ICM)培養(yǎng)而來。胚胎干細(xì)胞已經(jīng)在小鼠、人、猴子和大鼠上成功建系,滋養(yǎng)層干細(xì)胞也已經(jīng)在小鼠、人、兔子和猴上成功建立。但無論是胚胎干細(xì)胞還是滋養(yǎng)層干細(xì)胞,在有蹄類大動物上均未取得成功。由于豬在體型和相關(guān)生理功能方面都與人類十
2、分接近,所以豬胚胎干細(xì)胞和滋養(yǎng)層干細(xì)胞是研究人類相關(guān)基因疾病以及異種移植的最佳模型。本研究初步摸索豬滋養(yǎng)層干細(xì)胞的建系方法;同時構(gòu)建高表達(dá)白血病抑制因子(leukemia inhibitor factors,LIF)的飼養(yǎng)層細(xì)胞,并構(gòu)建豬源轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)載體,以期提高豬胚胎干細(xì)胞的質(zhì)量及建系效率。
目的:
通過接種體外受精囊胚,建立豬滋養(yǎng)層干細(xì)胞系;建立高效表達(dá)豬LIF的STO細(xì)胞系,優(yōu)化豬胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)條件;構(gòu)建豬
3、源轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)載體,輔助豬胚胎干細(xì)胞建系。
方法:
1.通過接種體外受精囊胚,建立豬滋養(yǎng)層干細(xì)胞系:通過體外受精和發(fā)育培養(yǎng)獲得第6天囊胚,去除透明帶后將全胚接種于STO飼養(yǎng)層上,用FGF系統(tǒng)干細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)滋養(yǎng)層干細(xì)胞,并利用機械切割的方法進(jìn)行傳代,通過形態(tài)學(xué)和堿性磷酸酶染色方法鑒定其干細(xì)胞特性。
2.通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的技術(shù),將已構(gòu)建的豬LIF基因真核表達(dá)載體pCAG-pLIF轉(zhuǎn)染至小鼠STO細(xì)胞中,通過藥物
4、篩選獲得能夠穩(wěn)定表達(dá)豬LIF的轉(zhuǎn)基因STO細(xì)胞(STO-pLIF細(xì)胞)。通過QPCR、Western blot等方法檢測STO-pLIF細(xì)胞中豬LIF的表達(dá)量。選擇高效表達(dá)豬LIF的STO-pLIF細(xì)胞作為飼養(yǎng)層,培養(yǎng)大鼠誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞(induced pluripotency stem cells,iPS)。通過生長曲線檢測、堿性磷酸酶染色、干細(xì)胞多能因子的RT-PCR檢測和免疫熒光染色等方法,檢驗STO-pLIF細(xì)胞飼養(yǎng)層在大鼠i
5、PS細(xì)胞培養(yǎng)方面的功能。
3.以豬胚胎成纖維細(xì)胞(pig embryonic fibroblast,PEF)的eDNA為模板,合成或擴增豬源OCT4、TBX3、REX1、LIN28、DPPA5五個轉(zhuǎn)錄因子,利用PCR方法,將REX1、LIN28、DPPA5以E2A和T2A序列連接成3因子片段并通過測序檢測其準(zhǔn)確性,將商業(yè)構(gòu)建的OCT4和TBX3以及自行構(gòu)建的三因子片段分別經(jīng)過限制性內(nèi)切酶酶切后連接到誘導(dǎo)表達(dá)載體pTRE3G-Z
6、sGreenI中,獲得三個重組表達(dá)載體。為了驗證所構(gòu)建質(zhì)粒功能,將豬源OCT4重組表達(dá)載體和pEFla-Tet3G質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入PEF細(xì)胞中,并在細(xì)胞培養(yǎng)時添加強力霉素(DOX)誘導(dǎo)外源轉(zhuǎn)錄因子表達(dá),通過QPCR檢測載體中豬源OCT4的表達(dá)情況。
結(jié)果:
1.所建立的滋養(yǎng)層干細(xì)胞系最高傳代至第9代,逐漸出現(xiàn)較多油滴,無法繼續(xù)傳代;由于傳代受限,無法有效擴增細(xì)胞系,后續(xù)的核型鑒定和堿性磷酸酶染色結(jié)果均不理想。
2
7、.獲得豬LIF轉(zhuǎn)基因陽性STO細(xì)胞系,STO-pLIF細(xì)胞中LIF基因和蛋白的表達(dá)量均有上調(diào);該細(xì)胞系作為飼養(yǎng)層所培養(yǎng)的大鼠iPS細(xì)胞在形態(tài)、多能性因子表達(dá)方面更接近于含LIF的傳統(tǒng)培養(yǎng)液培養(yǎng)的大鼠iPS細(xì)胞,顯著優(yōu)于無外源LIF添加的培養(yǎng)液所培養(yǎng)的大鼠iPS細(xì)胞。
3.成功構(gòu)建豬源轉(zhuǎn)錄因子重組表達(dá)載體,在豬源OCT4重組表達(dá)載體與pEF1a-Tet3G質(zhì)粒共轉(zhuǎn)PEF細(xì)胞并經(jīng)DOX誘導(dǎo)表達(dá)后,利用QPCR檢測發(fā)現(xiàn)其有效提高了P
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