人類胚胎干細(xì)胞無飼養(yǎng)細(xì)胞全系建立及初步研究.pdf

1、人類胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cells，hESCs)來源于植入前人類囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(inner cell mass，ICM)，是一種具有多向分化潛能和無限自我復(fù)制能力的特定細(xì)胞類型，為臨床細(xì)胞替代治療和人類胚胎發(fā)育機(jī)制研究等提供了理想的材料。目前，制約hESCs研究的一個重要的因素就是hESCs培養(yǎng)體系，目前普遍采用的是飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)體系，飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)體系由于其需要強(qiáng)度很到的勞動量和不穩(wěn)定性，生產(chǎn)的hESCs

2、細(xì)胞產(chǎn)量遠(yuǎn)不能夠滿足臨床和實(shí)驗(yàn)研究的需要，建立簡單穩(wěn)定的無飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)體系成為迫切的要求，同時無飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)體系有助于闡明hESCs維持未分化狀態(tài)的機(jī)制，也是hESCs定向誘導(dǎo)分化的基礎(chǔ)，也可以消除hESCs臨床應(yīng)用必需考慮動物源性成分帶來潛在的危險性。本研究的主要內(nèi)容是建立一種無飼養(yǎng)細(xì)胞hESCs體外培養(yǎng)體系，并對該無飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)體系進(jìn)行了初步研究。
　　 本論文第一章的研究內(nèi)容是建立了一種新的hESCs無飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)體系(稱

3、之為NB體系)，對該培養(yǎng)體系下培養(yǎng)的hESCs鑒定結(jié)果顯示，NB體系下hESCs和有飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)體系下hESCs一樣維持了自身的未分化狀態(tài)，表現(xiàn)出典型的未分化hESCs外觀，細(xì)胞高核質(zhì)比，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測結(jié)果顯示為Oct4、SSEA-4、TRA-A-60為陽性，AKP染色呈陽性，表達(dá)多能性基因Oct4、Sox2、Nanog和Rexl，在畸胎瘤中觀測到三胚層的細(xì)胞形成的組織結(jié)構(gòu)，具有向三胚層分化的潛能。hESCs解凍后依然保持了未分化狀態(tài)

4、。hESCs在NB培養(yǎng)體系培養(yǎng)的過程中，幾乎所有的種植克隆處于未分化狀態(tài)。同時，我們比較了4ng/ml、40ng/ml和100ng/ml FGF2對hESCs維持狀態(tài)的維持作用，結(jié)果表明，在4ng/ml FGF2濃度下(NB4體系)，未分化克隆百分比在無飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)早期出現(xiàn)V字形波動，而40ng/ml(NB40體系)和100ng/ml FGF2(NB100體系)始終維持高水平的未分化克隆百分壁，隨著無飼養(yǎng)細(xì)胞傳代的持續(xù)進(jìn)行，當(dāng)傳代培養(yǎng)8

5、～11代時，三種濃度FGF2條件下的hESCs未分化克隆百分比接近一致，說明高FGF2濃度對hESCs從有飼養(yǎng)細(xì)胞體系轉(zhuǎn)入到無飼養(yǎng)細(xì)胞體系時存在支持作用?？偟膩碚f，NB體系是一個非常穩(wěn)定高效的無飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)體系，不受飼養(yǎng)細(xì)胞波動的影響。
　　 論文第二章主要研究內(nèi)容是常規(guī)人源性飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)體系下(human embryonic feeder independent culture system，HEF體系)和NB體系下hESCs

6、特性比較。在本章節(jié)中，我們采用了細(xì)胞倍增時間，細(xì)胞周期，細(xì)胞凋亡，SSEA4和TRA-1-60 FACS分析，EBs分化傾向以及畸胎瘤評級等指標(biāo)來顯示2種培養(yǎng)體系下hESCs存在的差異。結(jié)果顯示，與有HEF體系相比較，NB體系下的hESCs具有較短的細(xì)胞倍增時間，HEF、NB4、NB40和NB100條件下平均細(xì)胞倍增時間分別為40.07±2.01 hrs、37.33±0.79 hrs、30.94±1.63 hrs和29.22±2.29

7、hrs，而細(xì)胞周期在這四種條件沒有明顯的改變，S期所占的百分比分別為41.75％±1.05％，42.90％±3.02％，41.48％±2.04％和41.34％±5.72％，細(xì)胞凋亡分別為10.8％±1.51％，8.44％±1.11％、5.96％±1.27％和3.61±％1.05％，說明，NB體系下hESCs增殖速度快主要的因素是抑制了細(xì)胞的凋亡，且與FGF2濃度存在正相關(guān)，與細(xì)胞周期沒有直接的聯(lián)系。就TRA-1-60和SSEA4的FAC

8、S分析結(jié)果來說，HEF、NB4、NB40和NB100體系下TRA-1-60陽性hESCs比率分別為71.6％±1.80％、93.0％±2.8％、87.8％±1.8％、83.1％±7.8％，而SSEA4陽性hESCs比率分別為81.5±5.46％，97.3％±0.8％、95.5％±2.5％、95.9％±2.4％，NB體系下的hESCs具有相對比較高的純度，尤其是NB4培養(yǎng)體系；當(dāng)NB體系下培養(yǎng)后的hESCs轉(zhuǎn)回到HEF體系培養(yǎng)后，TRA-

9、1-60和SSEA4陽性hESCs比率下降，介于HEF體系和NB體系之間，NB4、NB40和NB100轉(zhuǎn)回HEF體系后TRA-1-60+細(xì)胞比率分別為86.1％±4.6％、84.8％±2.0％、87.6％±1.0％，SSEA4+胞比率分別為89.2％±1.9％、85.8％±1.2％、87.9％±0.7％。在EBs自發(fā)分化傾向上，NB體系下的hESCs表現(xiàn)出分化抑制現(xiàn)象，主要體現(xiàn)在EBs分化過程中對多能行基因(Oct4、Nanog和Rex

10、l)的持續(xù)高表達(dá)和對三胚層(外胚層分化基因Sox3、Pax6、Soxl，中胚層分化基因Brachyury，內(nèi)胚層分化基因Sox17、AFP、GATA6)分化基因的低表達(dá)以及不表達(dá)。將NB體系下的hESCs重新轉(zhuǎn)入到有飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)體系培養(yǎng)后，在培養(yǎng)第11代時，培養(yǎng)中的hESCs出現(xiàn)了分化克隆，于第13代時進(jìn)行EBs分化傾向檢測，發(fā)現(xiàn)NB體系下來源的有飼養(yǎng)細(xì)胞體系下的hESCs的分化傾向得到一定程度的恢復(fù)，在EBs的培養(yǎng)過程中雖然高表達(dá)多能

11、性基因，但是三胚層分化基因的表達(dá)得到了恢復(fù)，包括了外胚層分化基因Sox3、Pax6、Soxl，中胚層分化基因Brachyury，內(nèi)胚層分化基因Sox17、AFP、GATA6。其中以NB4體系下hESCs恢復(fù)的比較完全，NB體系下高劑量的FGF2對hESCs分化能力的恢復(fù)存在抑制作用。HEF體系和NB體系下hESCs發(fā)生的分化傾向的改變可能與自身表面標(biāo)記分子陽性率的改變相關(guān)?？偟膩碚fNB體系下的hESCs比有飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)體系下的hESCs

12、具有高的細(xì)胞增殖能力，低細(xì)胞凋亡，具有較高的細(xì)胞純度，在EBs分化能力上受到一定的限制，但是在重新轉(zhuǎn)入到飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)體系后，其分化潛能可以得到不同程度的恢復(fù)，尤其是NB4體系下的hESCs，其TRA-1-60和SSEA4陽性細(xì)胞比率逐漸恢復(fù)到HEF體系下水平，hESCs分析傾向的改變可能與其自身表面分子標(biāo)記物陽性比率相關(guān)。
　　 論文第三章節(jié)主要內(nèi)容是研究hESCs自分泌對維持自身未分化狀態(tài)的作用。經(jīng)過檢測發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)中的hESC

13、s自身表達(dá)了多種維持自身未分化狀態(tài)的細(xì)胞因子，如FGF2、FGF4和Nodal等，同時也表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞分化的細(xì)胞因子，如BMP家族成員BMP2、BMP4和BMP7等。hESCs自身可以改變自身的微環(huán)境，與含有SR的培養(yǎng)體系相比較，NB體系具有的BMP樣誘導(dǎo)活性較低，但是當(dāng)hESCs克隆種植較高(100克隆/cm2)時，NB培養(yǎng)體系的BMP樣誘導(dǎo)活性得到增強(qiáng)；在含有SR的培養(yǎng)體系中也得到了類似的結(jié)果。由于hESCs自身表達(dá)了FGF2，存在F

14、GF信號通路的自分泌，為了檢測這種自分泌強(qiáng)度，當(dāng)hESCs在NB體系下的培養(yǎng)過程中撤除外源性的FGF2后，hESCs自身并沒有發(fā)生分化現(xiàn)象，同時，當(dāng)hESCs從HEF體系轉(zhuǎn)入到NB體系時，在沒有加入外源性的FGF2的條件下，hESCs同樣可以維持自身的未分化狀態(tài)，表達(dá)多能性基因Oct4、Nanog和Rexl和多能性標(biāo)記Oct4、TRA-1-60和SSEA4。當(dāng)然，hESCs分泌了其他的未知的細(xì)胞因子，對這些細(xì)胞因子的分離和鑒定后，在培養(yǎng)

15、體系中加入對hESCs維持未分化狀態(tài)的細(xì)胞因子和抑制促進(jìn)分化的細(xì)胞因子的功能，可以優(yōu)化和完善NB體系。國內(nèi)外的研究表明，hESCs分泌的細(xì)胞因子有助于hESCs的建系，所以對hESCs自分泌的研究為hESCs無飼養(yǎng)細(xì)胞建系和培養(yǎng)提供新的思路和方向。
　　 總的來說，無飼養(yǎng)細(xì)胞體系-NB體系是一個穩(wěn)定的高效的無飼養(yǎng)細(xì)胞hESCs培養(yǎng)體系，在該體系中，hESCs細(xì)胞的自分泌可以維持hESCs自身未分化狀態(tài)，hESCs自分泌為研究hE