嗜熱革節(jié)孢第一家族和第六家族糖苷水解酶的分子改造.pdf

1、纖維素在自然界中廣泛存在，而且含量豐富，是一種可再生資源，對(duì)解決能源短缺和資源枯竭具有重要意義。但是，我國(guó)的纖維素利用率很低，造成大量的浪費(fèi)。在纖維素的分解過(guò)程中，纖維素酶發(fā)揮非常大的作用，將纖維素最終分解為葡萄糖，使得纖維素能夠得到充分的利用。嗜熱革節(jié)孢是一種嗜熱真菌，能夠產(chǎn)生熱穩(wěn)定性酶，是纖維素的分解者之一。
　　本研究對(duì)來(lái)自嗜熱革節(jié)孢的外切葡聚糖酶基因cbhk和β-葡萄糖苷酶基因bgk進(jìn)行克隆，并在畢赤酵母中進(jìn)行表達(dá)，得到C

2、BHK和BGK重組酶。對(duì)重組酶進(jìn)行分離純化， SDS-PAGE電泳檢測(cè)蛋白分子量，外切葡聚糖酶CBHK的表觀分子量為72kDa，大于理論分子量50kDa，可能是糖基化造成的；β-葡萄糖苷酶BGK的分子量大小為55kDa與理論的分子量大小基本一致。
　　改善酶活性對(duì)提高纖維素的降解具有十分重要的作用?；谑葻岣锕?jié)孢β-葡萄糖苷酶HiBG的結(jié)構(gòu)，本研究對(duì)嗜熱革節(jié)孢β-葡萄糖苷酶活性位點(diǎn)進(jìn)口端的12個(gè)氨基酸殘基進(jìn)行定點(diǎn)突變。通過(guò)同源建模

3、，對(duì)來(lái)源于嗜熱革節(jié)孢的外切葡聚糖酶基因進(jìn)行四個(gè)位點(diǎn)的定點(diǎn)突變。并將它們?cè)诋叧嘟湍钢羞M(jìn)行了突變基因的高效表達(dá)。與野生型外切葡聚糖酶相比，突變體的酶活性都有所降低，其中W163H酶活性降低最多，降低了50％；E429D和Q459T分別降低了40%和35%；突變后W397H活性完全喪失。與野生型β-葡萄糖苷酶相比，所有突變體的酶活力都降低了，其中A260N、F348G、Y179F和F180H酶活性降低較少，分別降低了20%、20%、30%和3

4、0%；D237S、L173Q酶活性分別降低了55%和60%；而突變W168H、N335F和W349G的酶活性完全喪失。
　　在纖維素的分解過(guò)程中，β-葡萄糖苷酶起著關(guān)鍵作用，酶的催化存在產(chǎn)物抑制現(xiàn)象，大多數(shù)酶都存在產(chǎn)物抑制現(xiàn)象，但是一些酶對(duì)葡萄糖具有耐受性。嗜熱革節(jié)孢糖苷水解酶第一家族β-葡萄糖苷酶對(duì)葡萄糖具有耐受性,但是具體的作用機(jī)制尚不清楚。本研究，通過(guò)對(duì)嗜熱革節(jié)孢糖苷水解酶第一家族β-葡萄糖苷酶的12個(gè)進(jìn)口端位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變