提高11家族木聚糖酶嗜堿性的分子改造.pdf

1、木聚糖酶是降解植物半纖維素主要成分木聚糖的最關(guān)鍵的酶，廣泛應(yīng)用在動(dòng)物飼料、食品、造紙、生物能源等工業(yè)。木聚糖酶應(yīng)用在紙漿漂白工藝中可以減少有毒化學(xué)漂白劑的使用量，進(jìn)而減少后序漂白廢水的毒性和減輕對(duì)環(huán)境的污染。其中11家族木聚糖酶由于分子量小且無纖維素酶活性，很適合應(yīng)用于紙漿漂白工藝中。在紙漿漂白過程中紙漿多處于高溫堿性的環(huán)境下，為減少能耗和簡化工藝流程，需要選用嗜堿耐高溫的木聚糖酶。但是從自然界中分離到的野生型11家族木聚糖酶大多數(shù)是中

2、性酶，嗜堿木聚糖酶數(shù)量十分有限。因此需要對(duì)現(xiàn)有的野生型11家族木聚糖酶進(jìn)行分子改造來得到嗜堿性提高的木聚糖酶突變體。本研究以11家族木聚糖酶xyn11A-LC為基礎(chǔ)，利用GeneMorph II Random Mutagenesis kit隨機(jī)突變木聚糖酶xyn11A-LC基因建立突變文庫，從中篩選出嗜堿性提高的木聚糖酶突變體。主要研究成果如下：
　　1.利用GeneMorph II Random Mutagenesis kit隨

3、機(jī)突變木聚糖酶xyn11A-LC基因，建立了包含有5000多克隆的突變文庫。
　　2.通過對(duì)構(gòu)建的突變文庫進(jìn)行篩選，最終篩選出嗜堿性明顯提高的突變體M52-C10。突變體M52-C10的最適pH與野生型的相比提高了0.5個(gè)單位，達(dá)到pH8.0，在pH8.5-pH10.0與野生型的相比提高了大約10-15％的相對(duì)酶活，最適溫度為55℃，有較好的pH穩(wěn)定性和溫度穩(wěn)定性。
　　3.對(duì)突變體M52-C10的測(cè)序結(jié)果分析顯示出突變體M

4、52-C10含有兩個(gè)位點(diǎn)氨基酸的突變，分別是 E135 V和 V116 A。經(jīng)過驗(yàn)證 E135 V對(duì)突變體M52-C10的嗜堿性提高起到主要作用。E135 V的最適p H比野生型的提高了0.5個(gè)單位，為p H8.0，在pH8.5-p H10.0與野生型的相比提高了10-20%的相對(duì)酶活，最適溫度為55℃，有較好的pH穩(wěn)定性和溫度穩(wěn)定性。
　　4.對(duì)E135位分別進(jìn)行定點(diǎn)突變得到E135K和E135R。E135K的最適p H比野生型

5、的提高了0.5個(gè)單位，為p H8.0，在p H8.5- p H10.0與野生型的相比提高了10-19%的相對(duì)酶活；E135 R的最適p H與野生型的相比提高了0.5個(gè)單位，達(dá)到p H8.0，在pH8.5-p H10.0與野生型的相比提高了大約15-25%的相對(duì)酶活，最適溫度為55℃，有較好的pH穩(wěn)定性和溫度穩(wěn)定性。
　　5.總共得到比野生型木聚糖酶xyn11 A-LC嗜堿性明顯提高的三種突變體：E135 V、E135K和E135