奶牛組織器官SLC15家族的表達(dá)及二肽對(duì)小腸上皮細(xì)胞SLC15家族的影響.pdf

1、質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)載體15家族（Solute carrier15 family，SLC15）又被稱(chēng)為小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體家族，主要位于細(xì)胞膜上，能夠利用電化學(xué)梯度將短鏈肽和擬肽類(lèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。SLC15家族成員主要包括SLC15A1、SLC15A2、SLC15A3和SLC15A4，目前鮮有報(bào)道能夠全面地研究這些小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體在成年奶牛上的表達(dá)差異。小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體能夠轉(zhuǎn)運(yùn)腸道中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，它也受這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)調(diào)控。丙氨酰谷氨酰胺二肽（alanyl-glut

2、amine，Ala-Gln）作為小腸的主要能源物質(zhì)，它對(duì)腸道中小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體的調(diào)控也鮮有研究。因此本試驗(yàn)研究SLC15A1、SLC15A2、SLC15A3和SLC15A4在成年奶牛組織器官中的表達(dá)情況以及Ala-Gln對(duì)奶牛小腸上皮細(xì)胞(Bovine intestinal epithelial cells，BIECs)中小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體的調(diào)控作用，為SLC15家族在成年奶牛中的生物學(xué)功能以及Ala-Gln對(duì)BIECs的調(diào)控機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。<

3、br>　　試驗(yàn)一、小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體在成年奶牛組織器官中的表達(dá)
　　試驗(yàn)選取3頭健康的成年荷斯坦奶牛進(jìn)行屠宰，采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、瘤胃、網(wǎng)胃、瓣胃、皺胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸和直腸。試驗(yàn)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法對(duì)器官組織中的SLC15A1、SLC15A2、SLC15A3和SLC15A4mRNA進(jìn)行分析;采用Western Blot方法對(duì)器官組織中的SLC15A1、SLC15A2和SLC15A4蛋白進(jìn)行分析。試驗(yàn)

4、結(jié)果發(fā)現(xiàn)SLC15A1、SLC15A2、SLC15A3和SLC15A4 mRNA在器官組織中均能表達(dá)，但是在回腸中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)SLC15A2 mRNA的表達(dá)。SLC15A1在成年奶牛的肺臟、腎臟和空腸的表達(dá)極顯著高于其它器官組織(P＜0.01); SLC15A2在腎臟組織中的表達(dá)量均極顯著高于其它器官組織(P＜0.01);SLC15A3 mRNA在瘤胃、脾臟、結(jié)腸和肺臟中的表達(dá)極顯著高于其它器官組織(P＜0.01); SLC15A4在脾臟，

5、腎臟，肝臟，盲腸，結(jié)腸和肺臟中均有較高的表達(dá)水平。
　　試驗(yàn)二、奶牛小腸上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)及其小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體的表達(dá)
　　在無(wú)菌條件下分離奶牛小腸上皮組織，用胰酶消化獲得BIECs并純化，免疫熒光和瓊脂糖凝膠電泳鑒定BIECs，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)SLC15A1、SLC15A2、SLC15A3和SLC15A4 mRNA表達(dá);Western Blot檢測(cè)細(xì)胞中SLC15A1、SLC15A2和SLC15A4蛋白表達(dá)。結(jié)果表明，

6、BIECs的細(xì)胞質(zhì)中均含有細(xì)胞角蛋白18熒光，在細(xì)胞中檢測(cè)到絨毛蛋白、上皮細(xì)胞鈣粘蛋白和小腸脂肪酸結(jié)合蛋白基因的表達(dá)證實(shí)細(xì)胞為純化的BIECs。細(xì)胞中SLC15A1 mRNA的表達(dá)量極顯著高于SLC15A2、SLC15A3和SLC15A4 mRNA(P＜0.01)。SLC15A1蛋白的表達(dá)量最高，極顯著高于SLC15A2和SLC15A4(P＜0.01)。
　　試驗(yàn)三、Ala-Gln對(duì)奶牛小腸上皮細(xì)胞中小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體表達(dá)的影響

7、　　不同時(shí)間和濃度的Ala-Gln培養(yǎng)BIECs，確定最佳培養(yǎng)時(shí)間和濃度。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Ala-Gln、丙氨酸(L-alanine，Ala)和谷氨酰胺(L-glutamine，Gln)對(duì)BIECs中小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體及其相關(guān)基因mRNA的影響，Western Blot檢測(cè)Ala-Gln、Ala和Gln對(duì)BIECs中SLC15A1、SLC15A2和SLC15A4蛋白的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Ala-Gln能夠促進(jìn)BIECs增殖，其中1 mM

8、Ala-Gln在4h時(shí)極顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖(P＜0.01)，并且該組中SLC15A1mRNA、SLC15A2 mRNA、SLC15A3mRNA和SLC15A4 mRNA的表達(dá)量極顯著高于其它各組(P＜0.01)，顯著促進(jìn)SLC15A1蛋白的表達(dá)(P＜0.05)。Cdx2和PPAR-α mRNA的提高能夠上調(diào)SLC15A1mRNA的表達(dá)量。Ala-Gln培養(yǎng)BIECs后發(fā)現(xiàn)磷脂酰肌醇3激酶(pho sphatidylinositol3-ki

9、nase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)信號(hào)通路關(guān)鍵基因的表達(dá)都顯著升高（P＜0.05）。
　　綜上，SLC15A1、SLC15A2、SLC15A3和SLC15A4在成年奶牛中廣泛表達(dá)，但是它們?cè)谄鞴俳M織中的表達(dá)水平存在較大差異。SLC15A1 mRNA在BIECs中表達(dá)量最高，主要是通過(guò)Cdx2和PPAR-α基因調(diào)控的。Ala-Gln能夠上調(diào)小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體的表達(dá)，并且能上調(diào)PI3K/AKT傳導(dǎo)信