rAAV9--CAG-Hamp在鐵過載小鼠模型中治療的安全性和有效性評估.pdf

1、目的:鐵調(diào)素表達下調(diào)是引起非輸血依賴型地貧鐵過載的主要原因，目前認為可通過增加鐵調(diào)素的表達用于治療鐵過載疾病。通過構(gòu)建重組鐵調(diào)素-腺相關(guān)病毒載體，并轉(zhuǎn)染到鐵過載小鼠模型體內(nèi)，觀察其在鐵過載小鼠中對鐵代謝的影響，并探討其治療效果和相關(guān)作用機制，為非輸血依賴型地貧患者繼發(fā)性鐵過載的基因治療奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.構(gòu)建鐵過載小鼠模型，16周后通過病理HE染色觀察肝臟鐵過載情況。
　　2.包含目的基因小鼠hamp cD

2、NA的腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建、包裝、純化后獲得滴度滴度1×1012vg/ml。
　　3.鐵過載小鼠隨機分為A、B、C、D、E組5組，A、B、C組分別注射濃度為的:2.5×108vg/ml、2.5×109vg/ml、2.5×1010vg/ml的rAAV9-hamp、D組為2.5×1010vg/ml的含AAV-CAG、E組為PBS，注射體積分別為100μl。分別在第2天、14天、28天、56天分別處理5只小鼠，獲取相應的組織標本。采用熒

3、光檢測腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染效率、流式細胞計數(shù)法測定外周全血CD8+細胞比例、Real-Time PCR檢測肝臟hampmRNA表達情況、western blot檢測fpn蛋白表達情況以及亞鐵嗪法、化學發(fā)光微粒子免疫檢測法測定血清鐵及血清鐵蛋白(SF)濃度。
　　結(jié)果:
　　1.鐵過載小鼠模型肝臟、心臟HE染色見大量有明顯的鐵沉積。
　　2.熒光顯微鏡下見注射含CAG基因的AAV的小鼠肝臟中熒光蛋白表達強度要明顯高于PBS組;

4、在第56天時，其表達強度無明顯減弱。
　　3.各組注射AAV的小鼠外周血CD8+細胞比例與PBS組相比未見有明顯升高。4.低濃度實驗組的hamp mRNA表達量在第2天、14天和56天時與E組比明顯升高，但其升高水平較中濃度組（A組）低;中濃度實驗組（B組）的表達量在各時間段中的表達均明顯升高;高濃度組（C組）僅在第2天、14天、28天表達升高，而D組的hamp mRNA表達變化與E組均無差異。膜轉(zhuǎn)運鐵蛋白(fpn1)的蛋白濃度在

5、第2天時無明顯降低;14天之后，三組實驗組的蛋白濃度開始降低;第56天時，各實驗組蛋白仍有降低趨勢。各小組各時間段血清鐵變化中以B組在第56天與E組相比下降幅度最大，下降水平達E組的48.6％，而血清鐵蛋白濃度均無明顯改變。
　　結(jié)論:研究結(jié)果表明rAAV9-hamp可以在小鼠肝臟中成功轉(zhuǎn)染，并使hamp基因在肝臟細胞中長期穩(wěn)定表達;以中濃度hamp mRNA表達水平較為穩(wěn)定，且表達水平明顯高于PBS對照組; hamp高表達可降低