念珠地絲菌對(duì)五種抗真菌藥的體外敏感性及電鏡觀察.pdf

1、目的：近年來(lái)，系統(tǒng)性真菌感染的發(fā)病率在不斷上升，很多都是致命性感染，所以條件致病菌，尤其是罕見(jiàn)條件致病菌引起的感染事件應(yīng)引起足夠重視。念珠地絲菌（Geotricum sivicola）是新近發(fā)現(xiàn)的一種罕見(jiàn)地絲菌，目前國(guó)內(nèi)已有3例報(bào)道，因此對(duì)于條件致病菌的治療顯得尤為重要。目前藥品市場(chǎng)上可供選擇的抗真菌藥物很多，但各個(gè)藥物對(duì)不同真菌的敏感性差異很大，且隨著抗真菌藥的廣泛應(yīng)用，耐藥菌株的報(bào)道逐年增多。所以，研究并尋找抗真菌的敏感藥物，對(duì)日后

2、的臨床工作有著重要指導(dǎo)意義。
　　朱敬先等已經(jīng)對(duì)該菌進(jìn)行了一系列的研究，但地絲菌病的最佳治療方法尚無(wú)定論。本次試驗(yàn)分為兩部分，第一部分是運(yùn)用肉湯稀釋法檢測(cè)念珠地絲菌對(duì)五種抗真菌藥的體外敏感性，判定標(biāo)準(zhǔn)為美國(guó)的酵母樣真菌敏感性的界定標(biāo)準(zhǔn)。第二部分是在體外藥敏試驗(yàn)的基礎(chǔ)上應(yīng)用掃描電鏡觀察經(jīng)特比萘芬作用后念珠地絲菌的微觀形態(tài)學(xué)變化。本次試驗(yàn)從微觀形態(tài)學(xué)角度詳細(xì)觀察了特比萘芬對(duì)念珠地絲菌的破壞作用，為臨床治療念珠地絲菌感染提供新的指導(dǎo)依據(jù)

3、，為抗菌作用機(jī)制的研究也奠定了一定的基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.抗真菌藥對(duì)念珠地絲菌MIC值的測(cè)定
　　1.1.菌懸液的制備
　　將菌種復(fù)蘇并轉(zhuǎn)種后在無(wú)菌條件下，用生理鹽水沖洗斜面，在血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)，再用 RPMI-1640液體培養(yǎng)基稀釋，得到念珠地絲菌及質(zhì)控菌濃度均為1～5×105cfu/ml的菌懸液。
　　1.2.抗真菌藥的藥液制備
　　將實(shí)驗(yàn)所用五種藥物各自溶解，配成實(shí)驗(yàn)所需的貯存液，于-2

4、0℃冰箱保存。實(shí)驗(yàn)時(shí)用RPMI-1640培養(yǎng)基以2倍梯度稀釋，獲得10個(gè)2倍于終濃度的藥液。
　　1.3.藥液及菌懸液的接種
　　把所配置的五種藥物的10個(gè)濃度按序放入96孔板的前10個(gè)孔，將RPMI-1640培養(yǎng)基加入11～12孔，然后在1～11孔中分別加入菌懸液，在第12孔僅加入 RPMI-1640培養(yǎng)基。將實(shí)驗(yàn)板培養(yǎng)于37℃的恒溫培養(yǎng)箱里，連續(xù)培養(yǎng)5天后讀取結(jié)果。
　　1.4.結(jié)果判讀
　　依據(jù)NCCLS

5、M27-A2標(biāo)準(zhǔn)，讀取藥物對(duì)兩菌株的MIC值，將質(zhì)控菌株的MIC值與參考值對(duì)比，只有不超過(guò)參考值標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)才算作有意義。運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。
　　2.掃描電鏡標(biāo)本的制備
　　將特比萘芬組中濃度0.000156μg/ml、0.00125μg/ml、0.01μg/ml、0.08μg/ml及陽(yáng)性對(duì)照孔中的液體分別收集到5個(gè)無(wú)菌試管中，送掃描電鏡室。
　　結(jié)果：
　　1.抗真菌藥對(duì)念珠地絲菌的MIC值（μg/

6、ml）
　　伊曲康唑：0.0625～0.5、兩性霉素B：0.125～1、氟胞嘧啶：1～16、氟康唑：0.5～16、特比萘芬：0.0025～0.04。
　　2.特比萘芬作用念珠地絲菌前后掃描電鏡觀察
　　經(jīng)不同濃度特比萘芬作用5d后，掃描電鏡顯示念珠地絲菌的菌絲體出現(xiàn)了不同程度的破壞。特比萘芬濃度0.000156μg/ml作用下，菌絲表面變得粗糙不光滑、凹凸不平；濃度0.00125μg/ml作用下，菌絲皺癟、粗細(xì)不一；濃

7、度0.01μg/ml作用下，菌絲形態(tài)明顯改變，出現(xiàn)不規(guī)則缺損和蟲蝕狀孔洞；濃度0.08μg/ml作用下，菌絲體被徹底破壞呈現(xiàn)碎片狀；陽(yáng)性對(duì)照孔中的菌體表面光滑飽滿，菌絲粗細(xì)均勻。
　　結(jié)論：
　　1.在體外藥敏試驗(yàn)中，念珠地絲菌對(duì)伊曲康唑顯示劑量依賴性敏感，對(duì)特比萘芬、兩性霉素B、氟胞嘧啶、氟康唑均顯示敏感。其中特比萘芬的MIC值最低，對(duì)念珠地絲菌的抗菌活性最強(qiáng)。
　　2.通過(guò)掃描電鏡觀察菌體的微觀形態(tài)變化，證實(shí)特比萘