L-型電壓依賴性鈣通道α1亞單位在兔膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞基質(zhì)代謝中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、膝骨關(guān)節(jié)炎(Knee Osteoarthritis，KOA)是一種常見的以膝關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行性退變?yōu)榈湫吞卣鞯穆躁P(guān)節(jié)疾病。盡管近年來KOA治療方法和手段不斷改進(jìn)，但總體治療效果仍不理想，缺乏對(duì)KOA發(fā)病機(jī)制的深入理解是影響其治療效果的主要原因。
　　關(guān)節(jié)軟骨是骨性關(guān)節(jié)炎病變時(shí)最先和最主要的侵犯部位。關(guān)節(jié)軟骨包括軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)（主要是Ⅱ型膠原和蛋白聚糖）。骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)時(shí)，各種病理因素均直接或間接

2、地作用于軟骨細(xì)胞，使其調(diào)控的軟骨基質(zhì)合成與降解的動(dòng)態(tài)平衡體系失衡，并最終導(dǎo)致軟骨基質(zhì)的破壞。目前認(rèn)為，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(Calcineurin)參與并調(diào)控軟骨細(xì)胞增殖、分化，在關(guān)節(jié)軟骨的發(fā)育及骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要的角色。
　　離子通道(Ionic channels)是鑲嵌在細(xì)胞膜上的跨膜α-螺旋蛋白，允許特定的一些離子通過，是傳遞細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)的重要途徑。軟骨細(xì)胞雖然不是可興奮性細(xì)胞，但是作為活細(xì)胞系統(tǒng)，越來越多的實(shí)驗(yàn)證實(shí)

3、軟骨細(xì)胞膜具有靜息膜電位，并發(fā)現(xiàn)了形成靜息膜電位的多種通道和膜孔蛋白，如鈣激活的鉀通道，ATP敏感的鉀通道，電壓依賴性鉀通道，上皮鈉通道，電壓依賴性鈉通道，水通道，氯通道，NDMA受體(N-甲基-D-天門冬氨酸)，瞬時(shí)受體電位通道，電壓依賴性鈣通道等。雖然對(duì)每種通道的具體功能尚不完全清楚，但是可以肯定，細(xì)胞外各種機(jī)械刺激和生化的刺激信號(hào)會(huì)通過這些通道進(jìn)而影響軟骨細(xì)胞的功能?，F(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)多種離子通道調(diào)節(jié)劑對(duì)軟骨細(xì)胞膜電位產(chǎn)生影響，并影響了軟

4、骨細(xì)胞的增殖。有研究發(fā)現(xiàn)在軟骨細(xì)胞膜上存在L-型鈣通道α1亞基Cav1.2蛋白的表達(dá)，使用鈣通道阻滯劑維拉帕米降低軟骨細(xì)胞膜電位達(dá)18％以上。電壓依賴性鈣通道在正常軟骨細(xì)胞中的功能如何？骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變時(shí)，通道的改變以及調(diào)控機(jī)制如何？尚無相關(guān)研究報(bào)道。
　　采用膜片鉗，分子生物學(xué)和免疫學(xué)等方法，我們首次研究了KOA模型動(dòng)物膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞各種電壓依賴性鈣通道α1亞單位mRNA的表達(dá)，并探討了病理情況下Calcinurin在L-型電壓

5、依賴性鈣離子通道調(diào)控兔膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞基質(zhì)代謝中的作用。研究正常和疾病狀態(tài)下軟骨細(xì)胞膜離子通道電生理特征的變化，開發(fā)作用于離子通道的藥物，可為臨床開發(fā)治療KOA提供新的藥物靶點(diǎn)，并對(duì)軟骨細(xì)胞移植及軟骨組織工程等相關(guān)技術(shù)的完善提供幫助。
　　第一部分兔膝骨性關(guān)節(jié)炎(KOA)模型制作及鑒定
　　目的:兔KOA模型制作及鑒定。
　　方法:采用經(jīng)典Hulth法，制作兔雙腿KOA模型。手術(shù)后12周，通過觀察關(guān)節(jié)大體情況，HE染

6、色、組織病理學(xué)Markin評(píng)分、Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色、組織切片甲苯胺蘭染色和X線片對(duì)KOA模型的成功與否進(jìn)行多方面鑒定。
　　結(jié)果:X線片可見，術(shù)后12w的KOA組動(dòng)物膝關(guān)節(jié)內(nèi)股骨和脛骨邊緣骨贅形成;關(guān)節(jié)間隙不等寬，內(nèi)側(cè)較窄，關(guān)節(jié)面可見骨質(zhì)硬化。大體標(biāo)本可見滑膜大部分呈結(jié)節(jié)樣增生，滑液混濁，軟骨表面有嚴(yán)重缺損及潰瘍形成，軟骨下骨暴露，裂紋邊緣軟骨變軟，表面粗糙，呈灰黃色，周圍有大量骨贅形成。HE染色可見軟骨損傷程度嚴(yán)重，大范圍

7、的軟骨纖維化，且達(dá)及深層，細(xì)胞數(shù)明顯減少，分布不均勻，潮線不連續(xù)，鈣化層難以分辨;基質(zhì)嚴(yán)重失染，Mankin評(píng)分13-14分。免疫組化發(fā)現(xiàn)Ⅱ型膠原表達(dá)量比正常組明顯減少。組織切片甲苯胺藍(lán)染色發(fā)現(xiàn)軟骨組織比正常對(duì)照組染色程度明顯變淺。
　　結(jié)論:利用經(jīng)典Hulth法，成功建立了兔KOA模型。
　　第二部分兔KOA時(shí)軟骨細(xì)胞RT-qPCR內(nèi)參基因的選擇
　　目的:確定培養(yǎng)三代的軟骨細(xì)胞進(jìn)行RT-qPCR實(shí)驗(yàn)時(shí)最佳的內(nèi)參基因

8、。
　　方法:培養(yǎng)正常和KOA軟骨細(xì)胞，取前三代細(xì)胞，利用RT-qPCR技術(shù)對(duì)15種管家基因在各代軟骨細(xì)胞中的表達(dá)變化進(jìn)行分析，通過geNorm與NormFinder軟件對(duì)管家基因進(jìn)行穩(wěn)定性排序，然后用RefFinder軟件綜合上述兩種軟件得到的各基因穩(wěn)定值，對(duì)15種管家基因穩(wěn)定性進(jìn)行綜合排序，得到KOA時(shí)最穩(wěn)定內(nèi)參基因。
　　結(jié)果:15個(gè)內(nèi)參基因表達(dá)存在差異，geNorm與NormFinder軟件結(jié)果略有不同，RefFin

9、der綜合結(jié)果得出一代最佳匹配基因?yàn)镽PⅡ和YWHAZ，二代細(xì)胞為RPL13a和PPIA，三代細(xì)胞為RPL13a和RPⅡ，綜合前三代細(xì)胞RT-qPCR數(shù)據(jù)得到三代之前細(xì)胞穩(wěn)定內(nèi)參基因?yàn)閅WHAZ和RPⅡ。
　　結(jié)論:確定培養(yǎng)三代的軟骨細(xì)胞進(jìn)行RT-qPCR實(shí)驗(yàn)時(shí)最佳的內(nèi)參基因。
　　第三部分電壓依賴性鈣離子通道α1亞單位在兔膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞基質(zhì)代謝中的作用
　　目的:探討KOA時(shí)軟骨細(xì)胞電壓依賴性鈣離子通道α1亞單位

10、與細(xì)胞基質(zhì)代謝的關(guān)系。
　　方法:采用膜片鉗技術(shù)，觀察了兔KOA軟骨細(xì)胞靜息電位的變化。應(yīng)用RT-PCR技術(shù)，觀察了兔KOA軟骨細(xì)胞合成代謝和分解代謝指標(biāo)的mRNA表達(dá)改變，以及各種電壓依賴性鈣通道α1亞單位mRNA表達(dá)的變化。
　　結(jié)果:(1)正常和KOA時(shí)軟骨細(xì)胞膜靜息電位的變化:正常兔軟骨細(xì)胞靜息電位平均值為-37 mV，OA組細(xì)胞為-28 mV。與正常細(xì)胞相比，KOA細(xì)胞呈去極化表現(xiàn)，靜息電位值升高了25.2％(P＜

11、0.01)。(2)正常和KOA時(shí)軟骨細(xì)胞電壓依賴性鈣離子通道α1亞單位mRNA的表達(dá):本模型條件下，正常兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞僅有Cav1.2，Cav1.3，Cav1.4，Cav2.1，Cav2.2和Cav2.3的mRNA表達(dá)，未發(fā)現(xiàn)存在Cav1.1，Cav3.1和Cav3.3的mRNA表達(dá)。KOA時(shí)，軟骨細(xì)胞Cav1.3，Cav1.4和Cav2.1的mRNA表達(dá)增高，分別是正常軟骨細(xì)胞的4.37，8.96和3.63倍(P＜0.05，P＜0.

12、01)，Cav1.2，Cav2.2和Cav2.3的mRAN表達(dá)沒有明顯改變。(3)正常和KOA時(shí)軟骨細(xì)胞基質(zhì)合成代謝和分解代謝相關(guān)基因的mRNA表達(dá):正常兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞均有選擇的10種目的基因mRNA的表達(dá)，與正常相比，軟骨細(xì)胞的合成代謝指標(biāo)中ColⅡ，aggrecan-1，SOX-9和TGF-β的mRNA明顯降低。軟骨細(xì)胞的分解代謝指標(biāo)中各種酶的mRNA表達(dá)增多，尤其是MMP-1，ADAMTS-4和ADAMTS-5增多顯著(P＜0.

13、05)。
　　結(jié)論:KOA時(shí)通過鈣通道增加的鈣可能是軟骨細(xì)胞基質(zhì)合成代謝減少，分解代謝增加的原因之一。
　　第四部分 Calcinuerin在L-型電壓依賴性鈣通道調(diào)控兔膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞基質(zhì)代謝中的作用
　　目的:探討L-型電壓依賴性鈣通道是否是通過Calcinuerin調(diào)節(jié)了軟骨細(xì)胞基質(zhì)代謝。
　　方法:使用RT-PCR方法，首先觀察了KOA時(shí)軟骨細(xì)胞CaN和5種NFAT亞型的mRNA表達(dá)情況，然后分別使用L

14、-型電壓依賴性鈣通道阻斷劑硝苯地平（10μM），CaN抑制劑環(huán)孢素A（CsA，1μM），觀察CaN在L-型電壓依賴性鈣通道調(diào)控兔膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞基質(zhì)代謝中的作用。
　　結(jié)果:(1)正常和KOA軟骨細(xì)胞CaN和各亞型NFAT的mRNA表達(dá):正常和KOA兔CnAα，CnAβ，CnB以及5種NFAT的mRNA均有表達(dá)。與正常動(dòng)物相比，KOA兔軟骨細(xì)胞CnB的mRNA表達(dá)沒有顯著性變化，而CnAα，CnAβ均顯著降低，分別是對(duì)照組的0.

15、50和0.57倍(P＜0.05)。5種NFAT的mRNA表達(dá)變化并不一致。NFATc1降低最為顯著，是正常的0.34倍(P＜0.01)，而NFATc2明顯升高，是正常組的2.42倍(P＜0.01)，NFATc3，NFATc4和NFATc5的mRNA表達(dá)雖有降低趨勢(shì)，但沒有顯著性意義。因此我們選取KOA中變化最為明顯的CnAα，CnAβ，NFATc1和NFATc2來進(jìn)行下面的實(shí)驗(yàn)。(2) MTS法測(cè)定藥物對(duì)細(xì)胞活力的影響:與同時(shí)期的溶劑對(duì)

16、照DMSO組相比，硝苯地平和CsA作用72 h后，對(duì)KOA軟骨細(xì)胞的活力沒有影響(P＞0.05)。(3)硝苯地平和CsA對(duì)兔膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞代謝的影響:與溶劑對(duì)照組的KOA細(xì)胞相比，硝苯地平完全阻斷了KOA軟骨細(xì)胞Cav1.2，Cav.1.3和Cav1.4的mRNA表達(dá)。10μM硝苯地平增加了軟骨細(xì)胞內(nèi)基質(zhì)成分ColⅡ、agg-1和TGF-β的mRNA表達(dá)，降低了分解基質(zhì)的酶MMP-1，ADAMTS-4和ADAMTS-5的表達(dá)，分別是

17、對(duì)照組的7.48倍(P＜0.01)，5.16倍(P＜0.05)，4.81倍(P＜0.01)和0.17倍，0.34倍和0.10倍(P＜0.01)。1μM CsA降低了軟骨細(xì)胞ColⅡ的表達(dá)，升高了MMP-1的表達(dá)，是對(duì)照組的0.25倍和3.27倍(P＜0.01)。
　　與溶劑對(duì)照組的KOA細(xì)胞相比，10μ M硝苯地平明顯升高了CnAα的mRNA表達(dá)(P＜0.01)，是對(duì)照組的3.28倍，但是卻顯著降低了NFATc2的表達(dá)，是對(duì)照組的