耐輻射奇球菌PprM蛋白相互作用RNA的篩選及鑒定.pdf

1、研究背景：耐輻射奇球菌（Deinococcus radiodurans，DR）是目前地球上發(fā)現(xiàn)的最具有電離輻射抗性的生物之一，它對(duì)于電離輻射、紫外線、H2O2、干燥以及其他一些因素所導(dǎo)致的DNA和蛋白質(zhì)的損傷都具有極強(qiáng)的耐受與抵抗能力。DR這種極強(qiáng)的抗性自其發(fā)現(xiàn)以來(lái)一直是人們的研究熱點(diǎn)，但至今具體機(jī)制仍然不是很清楚。有研究表明PprM蛋白對(duì)耐輻射奇球菌的極端輻射抗性具有重要作用。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示PprM蛋白與冷休克蛋白具有很高的同

2、源性，擁有多個(gè)RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，提示其可能是一種 RNA結(jié)合蛋白，通過(guò)與目標(biāo)RNA結(jié)合發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)。
　　研究目的：為了研究PprM蛋白與RNA之間的相互作用，本研究擬構(gòu)建pprM過(guò)表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，分離純化獲得PprM融合蛋白，利用RNA pull-Down技術(shù)篩選與PprM蛋白質(zhì)具有相互作用的RNA，并利用EMSA和生物信息學(xué)方法驗(yàn)證兩者的相互作用。
　　研究方法：本研究通過(guò)構(gòu)建pGEX-6p-1-

3、pprM過(guò)表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，用IPTG誘導(dǎo)GST-PprM融合蛋白表達(dá)，利用GST瓊脂糖凝膠分離純化帶有GST標(biāo)簽的PprM蛋白；將純化后的PprM蛋白與GST瓊脂糖凝膠偶聯(lián)，然后與耐輻射奇球菌的總RNA充分孵育，進(jìn)行RNA pull-Down實(shí)驗(yàn)，通過(guò)多次洗脫，獲得與PprM蛋白具有相互作用的RNA；將獲得的靶RNA兩端連接上特異性的寡核苷酸接頭，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，PCR擴(kuò)增，并進(jìn)行TA克隆，構(gòu)建RNA子文庫(kù)，挑取單克

4、隆進(jìn)行測(cè)序分析，鑒定靶RNA種類，并利用EMSA和生物信息學(xué)的方法驗(yàn)證兩者的相互作用。
　　結(jié)果：成功構(gòu)建pGEX-6p-1-pprM過(guò)表達(dá)載體，經(jīng)測(cè)序分析，插入位置正確，序列沒(méi)有突變；利用IPTG成功誘導(dǎo)GST-PprM蛋白的表達(dá)，并通過(guò)親和層析成功獲得高純度的PprM融合蛋白；通過(guò)RNA pull-Down實(shí)驗(yàn)成功篩選到4個(gè)與PprM蛋白具有相互作用的靶RNA；通過(guò)生物信息學(xué)的方法預(yù)測(cè)表明PprM蛋白與4個(gè)RNA均具有相互作用