Dok6在原代培養(yǎng)的小鼠大腦皮層神經(jīng)元神經(jīng)突起生長(zhǎng)過(guò)程中的功能研究.pdf

1、Trk((t-)ropomyosin-(r-)elated(k-)inase，原肌球蛋白相關(guān)激酶)是細(xì)胞膜表面的一類(lèi)重要酪氨酸激酶，其在神經(jīng)細(xì)胞的存活、增殖、分化、遷移、凋亡以及學(xué)習(xí)和記憶等高級(jí)功能中都扮演著關(guān)鍵角色。Trk受體屬于受體酪氨酸激酶超家族，一共有三個(gè)家族成員：TrkA、TrkB和TrkC。他們的高親和力配體是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（neurotrophins）家族，該家族成員包括NGF、BDNF、NT-3、NT-4等等。通過(guò)與神經(jīng)營(yíng)

2、養(yǎng)因子相結(jié)合，Trk受體迅速二聚化并激活其自身酪氨酸激酶活性，進(jìn)而可以募集多種胞漿信號(hào)蛋白并將其磷酸化，從而將胞外信號(hào)傳遞至胞內(nèi)。
　　 Dok((d-)ownstream(o-)ftyrosine(k-)inase/Dockingprotein)是一類(lèi)重要的胞漿接頭蛋白，參與了多個(gè)信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)。該家族由七個(gè)成員組成：Dokl至Dok7。Dok家族蛋白符合胞漿信號(hào)蛋白的典型結(jié)構(gòu)特征：N端PH結(jié)構(gòu)域、中央PTB結(jié)構(gòu)域以及C末端區(qū)

3、域，因此可以作為多種非受體酪氨酸激酶（如Src家族激酶）及受體酪氨酸激酶（如胰島素受體、c-Ret受體、Trk受體等）的底物被募集及磷酸化，從而調(diào)節(jié)下游信號(hào)。
　　 本室前期工作表明Dok5可以與TrkB和TrkC受體相互作用并作為二者的底物激活MAPK信號(hào)通路。由于Dok5與Dok6均在神經(jīng)系統(tǒng)特異性高表達(dá)，并且同源性分析結(jié)果顯示二者在同家族的七個(gè)成員中同源性最高，因此我們預(yù)測(cè)Dok6可能也參與神經(jīng)系統(tǒng)中Trk受體家族的信號(hào)轉(zhuǎn)

4、導(dǎo)過(guò)程。接下來(lái)，首先利用酵母雙雜交系統(tǒng)進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果證明在酵母雙雜交系統(tǒng)中，Dok6與TrkC受體的胞內(nèi)區(qū)有明顯相互作用，而與TrkA和TrkB的相互作用很弱。通過(guò)結(jié)構(gòu)域分段克隆，進(jìn)一步證明了Dok6是通過(guò)其PTB結(jié)構(gòu)域與TrkC受體發(fā)生相互作用的。以上試驗(yàn)結(jié)果在GST-pulldown和CoIP實(shí)驗(yàn)中得到了進(jìn)一步的證實(shí)。隨后利用氨基酸突變分析的方法明確了Dok6通過(guò)其PTB結(jié)構(gòu)域結(jié)合于TrkC受體胞內(nèi)區(qū)的NPQY模體，并且這種相互作

5、用依賴(lài)于受體的激酶活性。
　　 為了在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)驗(yàn)證上述相互作用，我們利用原位雜交及免疫熒光實(shí)驗(yàn)證實(shí)TrkC受體與Dok6在來(lái)源于小鼠大腦皮層的原代培養(yǎng)的神經(jīng)元中共定位，并且免疫沉淀實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步在體內(nèi)證實(shí)了二者的相互作用，提示Dok6在神經(jīng)系統(tǒng)中作為T(mén)rkC受體的底物行使重要功能。通過(guò)RNA干擾技術(shù)，在原代培養(yǎng)的小鼠大腦皮層神經(jīng)元中敲低Dok6的表達(dá)并證明其在神經(jīng)突起的生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，隨后通過(guò)外源性NT-3的刺激證實(shí)Dok

6、6作為T(mén)rkC受體的底物通過(guò)NT-3/TrkC通路在原代培養(yǎng)的小鼠大腦皮層神經(jīng)元的神經(jīng)突起生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮作用。最后，利用免疫沉淀及質(zhì)譜鑒定的方法鑒定出可能與Dok6發(fā)生相互作用的26個(gè)蛋白，通過(guò)對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析最終鎖定9個(gè)參與了神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的靶蛋白。
　　 綜上所述，我們證實(shí)了Dok6依賴(lài)其PTB結(jié)構(gòu)域結(jié)合于活化的TrkC受體的NPQY模體，并且作為T(mén)rkC受體的底物通過(guò)NT-3/TrkC通路在原代培養(yǎng)的小