丹參酮生物合成相關(guān)基因的克隆及其代謝調(diào)控.pdf

1、心腦血管疾病是威脅人類健康與生命的“頭號(hào)殺手”。丹參(Salviamiltiorriza)為我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥材，其主要成分包括脂溶性的丹參酮化合物；而丹參酮是臨床治療心、腦血管疾病的重要藥物資源，最近的研究還表明丹參酮具有抗癌作用，因此，丹參在臨床上具有廣泛的應(yīng)用。然而，丹參可用資源有限及有效成分含量低使之應(yīng)用受限。
　　 本研究以丹參為材料，在本實(shí)驗(yàn)室前期工作基礎(chǔ)之上，利用RACE技術(shù)克隆丹參酮代謝合成關(guān)鍵酶基因，克隆得到牻牛

2、兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶基因(SmGGPPS,GenBank Accession No.FJ643617)和3-羥基-3-甲基戊二酰CoA還原酶基因(SmHMGR，GenBank Accession No.EU680958)的全長(zhǎng)cDNA序列，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)和表達(dá)模式的分析及在大腸桿菌中對(duì)SmGGPPS進(jìn)行了顏色互補(bǔ)功能驗(yàn)證。
　　 SmHMGR cDNA全長(zhǎng)2115bp，包括1695bp的開(kāi)放閱讀框，編碼565個(gè)氨基酸。

3、氨基酸多重序列比對(duì)結(jié)果顯示SmHMGR與其他植物的HMGR有較高的同源性。進(jìn)化樹(shù)分析表明，SmHMGR與胡黃連(Picrorhiza kurrooa)HMGR的親緣關(guān)系最近。組織特異性表達(dá)分析結(jié)果表明，SmHMGR基因在丹參中為組成型表達(dá)，且根中的表達(dá)最強(qiáng)，莖中表達(dá)次之，葉片中表達(dá)最弱。水楊酸(SA)誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)表明，SmHMGR在葉片中受到水楊酸的誘導(dǎo)。甲基茉莉酸(MJ)誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)表明，SmHMGR在不同組織中都不同程度上受到誘導(dǎo)。暗示Sm

4、HMGR是一個(gè)誘導(dǎo)響應(yīng)型的基因。
　　 SmGGPPS全長(zhǎng)1234bp，包括1092bp的開(kāi)放閱讀框，編碼364個(gè)氨基酸。氨基酸多重序列比對(duì)結(jié)果顯示SmGGPPS與其他植物的GGPPS有較高的同源性。進(jìn)化樹(shù)分析表明，SmGGPPS與煙草(Nicotiana attenuate)GGPPS的親緣關(guān)系最近。在大腸桿菌中的功能驗(yàn)證表明SmGGPPS能夠促進(jìn)類胡蘿卜素的合成，證明SmGGPPS編碼一個(gè)有功能的蛋白。組織特異性表達(dá)分析結(jié)果

5、表明，SmGGPPS基因在丹參中為組成型表達(dá)，且葉片中的表達(dá)最強(qiáng)，根中表達(dá)次之，莖中表達(dá)最弱。水楊酸(SA)誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)表明，SmGGPPS在葉片中也受到水楊酸的誘導(dǎo)。而甲基茉莉酸(MJ)誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)表明，SmGGPPS在不同組織中都受到MJ的抑制。暗示SmGGPPS也是一個(gè)誘導(dǎo)響應(yīng)型的基因。
　　 繼而采用RT-PCR和HPLC等技術(shù)，較全面地分析了不同誘導(dǎo)子如MJ、Ag+、YE、YE+Ag+等處理丹參毛狀根前后丹參酮合成相關(guān)基因如S

6、mHMGR，SmGGPPS,SmDXR，SmAACT,SmCMK,SmIPPI,SmFPPS,SmCPS,SmKSL等的表達(dá)與丹參酮積累的相關(guān)性，結(jié)果表明，丹參酮的生物合成在轉(zhuǎn)錄水平上受到調(diào)控，在不同誘導(dǎo)子處理下，丹參毛狀根中丹參酮含量的積累可能是丹參酮代謝途徑上的多個(gè)基因共同上調(diào)表達(dá)的結(jié)果。同時(shí)，SmHMGR，SmDXS2，SmFPPS,SmGGPPS和SmCPS被鑒定為調(diào)控丹參酮生物合成可能的關(guān)鍵酶基因。以上研究工作為進(jìn)一步闡釋不同