丹參次生代謝相關(guān)基因SmKSL3及SmSPLs的克隆與分析.pdf

1、丹參Salvia miltiorrhiza Bunge,屬唇形科（Lamiaceae）鼠尾草屬(Salvia Linn)，是重要的藥用植物。丹參使用歷史悠久，最早記錄見于距今兩千多年的《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品，用于治療心腦血管等諸多疾病。丹參主要有效成分為：水溶性的丹酚酸類和脂溶性的丹參酮類，其中丹參酮屬于二萜醌類。為了弄清丹參酮生物合成途徑，本研究以丹參基因組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，經(jīng)過基因克隆、基因結(jié)構(gòu)分析和表達(dá)模式分析以及遺傳轉(zhuǎn)化等手段，對

2、丹參次生代謝相關(guān)基因類貝殼杉烯合酶基因SmKSL3和轉(zhuǎn)錄因子SmSPL進(jìn)行了研究，并利用T-DNA插入激活標(biāo)簽載體構(gòu)建丹參突變體庫以期尋找到更多與次生代謝相關(guān)的基因?；诜治龊蛯?shí)驗(yàn)取得了如下的結(jié)果：
　　1、丹參SmKSL3基因克隆與表達(dá)調(diào)控分析
　　在丹參基因組數(shù)據(jù)中，經(jīng)過與SmKSL1及擬南芥等模式植物的KSL基因進(jìn)行同源比對，推測基因組中的一個(gè)長285bp的contig為丹參KSL基因片段，據(jù)此設(shè)計(jì)引物、運(yùn)用RACE及

3、RT-PCR技術(shù)首次克隆得到編碼區(qū)全長1245bp的另一個(gè)與丹參酮合成相關(guān)的重要基因：SmKSL3。
　　基因結(jié)構(gòu)分析表明：SmKSL3含有5′端的非翻譯區(qū)（5′UTR）208bp,在3′端有明顯的polyA結(jié)構(gòu)，顯示出完整的基因結(jié)構(gòu)，其編碼區(qū)長1245bp,蛋白質(zhì)分子式為C2123H3321N565O638S24，含有414個(gè)氨基酸，屬疏水性不穩(wěn)定蛋白。經(jīng)保守域（conserve domain）、跨膜區(qū)、二級結(jié)構(gòu)及立體結(jié)構(gòu)等生信

4、分析，推測SmKSL3屬于I類丹參合酶，參與催化GPP、FPP或GGPP環(huán)化形成單萜、倍半萜或二萜尤其是萜烯的合成。將序列相似度較高的9種植物KSL基因與SmKSL1和SmKSL3進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，顯示丹參SmKSL1和SmKSL3基因與其他物種相似的基因在遺傳上都有一定距離。這些物種都不作為藥用植物，據(jù)此可推知丹參作為藥用植物，其有效成分、次生代謝物的生物合成可能有不同的下游途徑。
　　構(gòu)建了SmKSL1-GFP和SmKSL3

5、-GFP融合表達(dá)載體，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草，經(jīng)激光共聚焦顯微鏡觀察其瞬時(shí)表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)SmKSL3-GFP定位于細(xì)胞質(zhì)，而SmKSL1-GFP定位于葉綠體。基因表達(dá)模式分析顯示SmKSL1和SmKSL3均在根中高表達(dá)，對外施茉莉酸甲酯（JA）有響應(yīng)：SmKSL1在36h時(shí)表達(dá)顯著升高，SmKSL3則在24h時(shí)顯著升高。據(jù)此推測SmKSL1和SmKSL3均可能參與丹參次生代謝過程，并且在時(shí)間和空間上是相對獨(dú)立的：SmKSL1定位于質(zhì)體，主

6、要參與質(zhì)體途徑合成萜類，而SmKSL3缺少N-端的細(xì)胞器定位信號(hào)，主要在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮作用。SmKSL1和SmKSL3在不同的時(shí)間點(diǎn)響應(yīng)外界刺激，對生物體具有重要的生理作用。
　　為后續(xù)深入研究SmKSL1和SmKSL3的功能，構(gòu)建了原核表達(dá)載體，并在大腸桿菌中成功表達(dá)出蛋白質(zhì)并純化，蛋白純度均>90％。將SmKSL3與含兩個(gè)CaMV35S強(qiáng)啟動(dòng)子的PBI121載體連接構(gòu)建了SmKSL3過表達(dá)載體。另外利用人工小RNA技術(shù)構(gòu)建了Sm

7、KSL3-artificial miRNA敲減載體。兩種載體均用農(nóng)桿菌介導(dǎo)進(jìn)行丹參的遺傳轉(zhuǎn)化，經(jīng)初步鑒定獲得過表達(dá)SmKSL3的轉(zhuǎn)基因丹參植株3株和SmKSL3 knock-down的轉(zhuǎn)基因丹參植株6株。為進(jìn)一步深入研究SmKSL3的功能、揭示SmKSL1和SmKSL3的功能分工奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
　　2、丹參SmSPL轉(zhuǎn)錄因子的克隆與調(diào)控及功能分析
　　功能的T-DNA插入載體PBI-intron-GUS-4Enhancer

8、，用此載體轉(zhuǎn)化丹參建立丹參
　　體系，并獲得插入突變陽性植株，其中1株具有明顯表型。為發(fā)現(xiàn)和研究丹參次
　　生代謝相關(guān)新基因奠定了基礎(chǔ)。
　　突變體庫。在此過程中，除了用已報(bào)道的遺傳轉(zhuǎn)化方法，我們用鏈霉素
　　SPL（SQUAMOSA promoter binding protein-likes）是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。通過對丹參基因組序列的分析、比對，預(yù)測出15個(gè)SmSP

9、L基因，隨后利用RACE和RT-PCR法對它們進(jìn)行了分子克隆。序列測定和分析結(jié)果表明，丹參SmSPL具有多樣化的序列特征和基因結(jié)構(gòu)。丹參SmSPL基因均含有SBP結(jié)構(gòu)域，大多與兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)（CX4CX16CX2H和CX4CX16CX2C）相重合。比較分析表明丹參SmSPL和對應(yīng)的擬南芥AtSPL之間具有序列的保守性。將丹參SmSPL和擬南芥AtSPL進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)丹參SmSPL可分為6個(gè)組。同一組或同一亞組內(nèi)的SPL往往含有相同的m

10、otif，暗示這些SPL的功能可能是相近或冗余的。如：AtSPL8與花青素和赤霉素的生物合成等有關(guān)，二者與次生代謝密切相關(guān)，而SmSPL12與AtSPL8同屬一組，暗示SmSPL12也有可能參與丹參花青素形成等次生代謝過程。另外經(jīng)預(yù)測發(fā)現(xiàn)8個(gè)丹參SPL是miR156/157的靶基因。用改良的5′-RACE方法驗(yàn)證了miR156/157的靶基因和切割位點(diǎn)。
　　丹參SPL基因在不同組織中差異表達(dá)。受miR156/157調(diào)控的那些丹參

11、SPL（SmSPL2,SmSPL3,SmSPL5,SmSLP6,SmSPL8,SmSPL11,SmSPL14,SmSPL15）的表達(dá)量隨著丹參植株的成熟而升高，然而在此過程中，miR156/157的表達(dá)量下降。這一方面證實(shí)了miR156/157對SmSPL基因的調(diào)控作用，另一方面也表明SmSPL在丹參發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。此外，丹參植株成熟過程中，miR156/157的表達(dá)與miR172的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。miR156、miR172和SP

12、L主要調(diào)控植物從營養(yǎng)生長向生殖生長過渡的時(shí)間。這種生長階段的轉(zhuǎn)變對于植物次生代謝物的積累有重大的影響。我們獲得的這些結(jié)果暗示了SmSPL、miR156和miR172介導(dǎo)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在丹參發(fā)育階段調(diào)控中的重要性和復(fù)雜性。
　　3、T-DNA插入激活標(biāo)簽突變體庫的構(gòu)建
　　為了發(fā)現(xiàn)更多參與丹參次生代謝途徑的基因，構(gòu)建了兼有激活標(biāo)簽和基因捕獲功能的T-DNA插入載體PBI-intron-GUS-4Enhancer，用此載體轉(zhuǎn)化丹參建