煙草細胞周期蛋白依賴性激酶NtCDK8基因的克隆及功能分析.pdf

1、自然界的任何物種，都彌足珍貴。而植物更是與人類的生活息息相關。藻類通過光合作用所釋放的氧氣，是生命進化的基礎;起源于美索不達米亞的小麥，墨西哥的玉米，中國浙江的水稻幾千年來一直見證著、支撐著人類的成長。植物的重要價值及其存在意義自不言而喻。植物細胞的的分裂分化最終導致了完整的植株，因此從微觀上研究植物細胞的分裂分化過程，對于改造植物的個體性狀是一致的。
　　CDK(cyclin-dependent kinase)是在上世紀八十年代

2、從酵母中發(fā)現(xiàn)的。近幾十年的研究發(fā)現(xiàn)其在細胞周期的調(diào)控過程中發(fā)揮著重要作用。但一直以來植物中的CDK研究的并不多。本文通過對煙草的CDK家族進行生物信息學分析及對其E類亞家族基因CDK8進行克隆、轉(zhuǎn)基因研究，為煙草及其他植物的細胞周期調(diào)控研究奠定了數(shù)據(jù)基礎。本研究獲得了主要結(jié)果如下:
　　1、通過同源序列比對及進化分析，發(fā)現(xiàn)煙草中的CDK和其他物種一樣可以劃分為A、B、C、D、E、F、G有功能報道的七類及有一些預測功能或結(jié)構(gòu)相似的C

3、DK-Like類。其中NtCDKA有四個，NtCDKB有兩個，NtCDKC有兩個，NtCDKD/E/F/G分別有一個，NtCDK-Like有12個，即本研究鑒定發(fā)現(xiàn)煙草中共有24個CDK基因。且通過多序列比對發(fā)現(xiàn)，每一個亞家族基因都具有極其保守其相對特異的Cyclin結(jié)合域。
　　2、為了探索細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)在煙草中的生物學功能，通過同源性搜索的方法獲得了煙草細胞周期蛋白依賴性激酶基因的EST序列。采用RT-PCR

4、技術(shù)，從煙草栽培品種紅花大金元中成功克隆出了細胞周期蛋白依賴性激酶基因，并命名為NtCDK8。NtCDK8基因cDNA編碼區(qū)全長為1422bp，編碼473個氨基酸。生物信息學同源性比對分析:NtCDK8與擬南芥、苜蓿的CDK8具有較高的同源性，且編碼的蛋白質(zhì)具有相同的結(jié)構(gòu)特征;蛋白結(jié)構(gòu)預測分析:NtCDK8具有Serine/Threonine蛋白激酶結(jié)構(gòu)域，可以通過促使下游蛋白中的絲氨酸蘇氨酸殘基磷酸化，從而促使細胞外信號向細胞內(nèi)傳遞;

5、通過疏水性、信號肽及亞細胞定位預測綜合分析表明，蛋白NtCDK8可能是一個在細胞核中發(fā)揮功能的親水性蛋白。表達模式分析結(jié)果顯示NtCDK8在干旱、鹽脅迫、低溫處理下表達量有很大變化，表明NtCDK8參與了環(huán)境信號的調(diào)控;激素處理分析表明，煙草在受到生長素、脫落酸等外源激素處理后，其NtCDK8表達水平變化很大，表明NtCDK8很可能參與了煙草細胞的分裂分化過程;同時表達譜分析NtCDK8的表達具有組織特異性。亞細胞定位的結(jié)果表明NtCD

6、K8大部分存在于細胞核內(nèi)，這一結(jié)果是和其細胞周期蛋白依賴性激酶的性質(zhì)是一致的，也和生物信息學的分析結(jié)果相同。
　　為了更進一步的解釋NtCDK8的生物學功能，本研究同時進行了轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?。目前已獲得了通過PCR鑒定、蛋白實驗檢驗的轉(zhuǎn)基因植株。通過病原菌PstDC3000的接菌實驗，結(jié)果表明NtCDK8轉(zhuǎn)基因植株的抗PstDC3000的能力發(fā)生了穩(wěn)定的變化。說明NtCDK8參與到了機體免疫的過程。顯微觀察發(fā)現(xiàn)NtCDK8轉(zhuǎn)基因植株的葉