細(xì)胞周期素依賴性激酶5在SD大鼠大腦的分布及Roscovitine對(duì)其影響.pdf

1、背景：細(xì)胞周期素依賴性激酶5(CDK5)屬絲氨酸—蘇氨酸激酶家族，相對(duì)分子質(zhì)量在30～35KD，在不同器官的組織中均有表達(dá)，但主要集中在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)。它是神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育、分化、遷移及突觸形成的重要調(diào)節(jié)因子，在神經(jīng)細(xì)胞的遷移、分化，突起的生長(zhǎng)和突觸的形成等方面起著重要作用。它在退行性神經(jīng)疾病和神經(jīng)損傷方面也起了一定的作用。Roscovitine是一種嘌呤類似物，它是細(xì)胞周期素依賴性激酶的選擇性抑制劑。它通過(guò)與CDK5競(jìng)爭(zhēng)性與ATP

2、位點(diǎn)結(jié)合而抑制其活性，通過(guò)抑制CDK5的過(guò)表達(dá)而具有神經(jīng)保護(hù)作用。它還具有抑制細(xì)胞增殖引起細(xì)胞凋亡的作用，因而在抗腫瘤方面也起一定的作用，目前已進(jìn)入二期臨床試驗(yàn)階段。巢蛋白(Nestin)是相對(duì)分子質(zhì)量為200～240KD的第Ⅵ類中間絲蛋白，發(fā)現(xiàn)于脊髓神經(jīng)管，被認(rèn)為是神經(jīng)前體細(xì)胞和干細(xì)胞的標(biāo)志物之一。在維持神經(jīng)前體細(xì)胞正常形態(tài)和神經(jīng)細(xì)胞的增殖、分化過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。
　　 目的：研究確認(rèn)細(xì)胞周期素依賴性激酶5(CDK5)在

3、不同年齡組SD大鼠大腦內(nèi)的分布部位，進(jìn)一步研究在新生鼠內(nèi)，抑制劑Roseovitine對(duì)CDK5的抑制作用。為深入探討CDK5對(duì)Nestin蛋白的調(diào)節(jié)作用提供基礎(chǔ)資料。
　　 方法：⑴以雄性Sprague—Dawley(SD)為研究對(duì)象，實(shí)驗(yàn)分為新生鼠、幼年鼠和成年鼠組。利用免疫組織化學(xué)染色的方法，明確CDK5在不同年齡組SD大鼠大腦中的分布情況。⑵取24h內(nèi)SD新生鼠的皮質(zhì)和海馬進(jìn)行神經(jīng)元原代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分Control組、5、

4、10、20μmol/L Roscovitine處理組，細(xì)胞接種后24h用Roscovitine對(duì)神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行處理，繼續(xù)培養(yǎng)24h后提取蛋白。對(duì)蛋白進(jìn)行濃度定量測(cè)定，通過(guò)Westernblot方法檢測(cè)不同濃度Roscovitine在未分化神經(jīng)細(xì)胞中對(duì)CDK5蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。
　　 結(jié)果：①免疫組化觀察在新生鼠大腦皮質(zhì)，幼年鼠和成年鼠大腦皮質(zhì)、海馬、丘腦、下丘腦及紋狀體等部位均有CDK5的表達(dá)。其中，在新生鼠大腦皮質(zhì)中CDK5陽(yáng)

5、性細(xì)胞表達(dá)量為208.00±19.66；在幼年鼠皮質(zhì)、海馬、丘腦中CDK5陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)分別為82.80±5.80、45.60±9.99和56.90±12.40；在成年鼠皮質(zhì)、海馬、丘腦中CDK5陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)分別為117.50±14.92、99.90±18.55和111.80±8.34。在大鼠大腦的不同部位及不同年齡組(幼年組和成年組)大鼠間，CDK5表達(dá)存在差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在幼年鼠基底前腦的內(nèi)側(cè)隔核(MS)、斜角帶水

6、平支(hDB)和垂直支(VDB)有少量CDK5陽(yáng)性細(xì)胞，而成年鼠基底前腦未見(jiàn)其陽(yáng)性表達(dá)。②與對(duì)照組相比，不同濃度Roscovitine處理的細(xì)胞，CDK5的表達(dá)量均有所減少。且分光光度計(jì)蛋白定量測(cè)定顯示，經(jīng)5、10、20μmol/L不同濃度Roscovitine處理的細(xì)胞，其CDK5蛋白的表達(dá)隨濃度的增加而逐漸下降。以β—actin為內(nèi)參，Western blot顯示條帶逐漸減弱，灰度掃描顯示Control、5、10、20μmol/L其

7、相對(duì)光密度分別為0.98±0.02、0.87±0.05、0.72±02、0.46±0.06。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)Roscovitine處理濃度為5、10、20μmol/L時(shí)的CDK5表達(dá)與對(duì)照組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且CDK5的表達(dá)量呈濃度依賴性下降。
　　 結(jié)論：⑴在SD大鼠大腦中，CDK5主要分布在大腦皮質(zhì)、海馬及丘腦部位，在下丘腦及紋狀體等部位也有表達(dá)；在幼年組基底前腦有少量CDK5表達(dá)，但在成年鼠基底前腦的神經(jīng)元

8、中未見(jiàn)CDK5表達(dá)。這可能表明，在發(fā)育過(guò)程中基底前腦的CDK5表達(dá)呈下降趨勢(shì)。也提示在成年鼠的成熟神經(jīng)元中CDK5與Nestin蛋白可能并無(wú)直接調(diào)節(jié)機(jī)制。⑵24h內(nèi)新生鼠取材，原代神經(jīng)元培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)Roscovitine處理后，CDK5的表達(dá)量隨處理濃度的升高而逐漸下降。表明在神經(jīng)細(xì)胞增值、分化和遷移過(guò)程中，Roscovitine對(duì)CDK5的表達(dá)存在抑制作用。通過(guò)這種調(diào)節(jié)作用，可以進(jìn)一步研究CDK5對(duì)Nestin的調(diào)節(jié)作用，尤其是對(duì)其的磷