斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白家族部分基因的分子克隆及表達分析.pdf

1、親蝦繁育技術在對蝦養(yǎng)殖過程中一直是一個非常重要的限制因素，而通常采用的眼柄切除技術或者捕撈野生親蝦的方法在實際生產活動中存在傷害親蝦或者資金投入過大等問題。因此探尋新的親蝦繁育技術勢在必行。本實驗擬在分子層面，以斑節(jié)對蝦為模式生物對卵巢發(fā)育相關的細胞周期蛋白H，細胞周期蛋白E等基因進行研究，進而為斑節(jié)對蝦卵巢發(fā)育調控機理的研究打下基礎。
　　本實驗是在實驗室通過高通量測序建立的EST文庫的基礎上,篩選出了幾個與卵巢發(fā)育相關的細胞周

2、期蛋白EST序列,利用cDNA末端快速擴增技術克隆出全長cDNA序列，并利用實時定量熒光PCR技術對這些發(fā)育相關基因在組織分中布，卵巢不同發(fā)育時期的表達，以及經過蛻皮抑制激素（MIH）注射后相應的表達情況進行了分析。此外還選取了具有代表性的細胞周期蛋白B進行了重組表達及免疫組化研究。
　　結果如下：
　　1）采用 RACE技術克隆得到一條全長1706bp的細胞周期蛋白 E基因cDNA序列，并命名為PmcycE。該序列包含13

3、2bp的5’非編碼區(qū)（UTR）和311bp的3’非編碼區(qū)以及1263bp的開放閱讀框（ORF），可編碼420個氨基酸。預測的分子量約為47.91kDa，理論等電點5.85。生物信息學軟件分析表明該氨基酸序列含有周期蛋白家族特有的CYCLIN保守區(qū)并含有N-糖基化位點及磷酸化位點，經BLAST同源性分析發(fā)現(xiàn)，與Solenopsis invicta（紅火蟻），Megachile rotundata（切葉蜂）等多種節(jié)肢動物有很高的同源性。熒光

4、定量PCR顯示，該基因在斑節(jié)對蝦精巢，卵巢，腸，腦，肝胰腺，胃和心等各組織中均有表達，在卵巢和眼柄中表達量明顯高于其他組織，心臟，胃及肝胰腺表達量相對較低。分別對 MIH注射和眼柄切除的對蝦進行表達分析，發(fā)現(xiàn)眼柄切除切除后，細胞周期蛋白 E大量表達，而注射MIH后細胞周期蛋白E的表達量相對降低。
　　2)采用RACE技術克隆得到一條全長1280bp的細胞周期蛋白H基因cDNA序列，并命名為PmcycH。該序列包含63bp的5’非編

5、碼區(qū)（UTR）和218bp的3’非編碼區(qū)以及999bp的開放閱讀框（ORF），可編碼332個氨基酸。預測的分子量約為39kDa，理論等電點6.39。利用BLAST及系統(tǒng)進化樹分析顯示該PmcycH屬于細胞周期蛋白H家族。熒光定量PCR顯示，該基因在斑節(jié)對蝦精巢，卵巢，腸，腦，肝臟，胃，肌肉和心等各組織中均有表達，在卵巢中表達量明顯高于其他組織，心臟，腦及肝臟表達量相對較低。通過實時熒光定量的方法發(fā)現(xiàn)，PmcyclinH在斑節(jié)對蝦卵巢的不

6、同發(fā)育時期的分布并不相同，表明 PmcyclinH與細胞周期調控及卵巢發(fā)育有關。
　　3)設計原核表達引物從斑節(jié)對蝦的卵巢cDNA中克隆出周期蛋白B的開放閱讀框（ORF），并與PET-21a載體連接，轉化大腸桿菌BL21(DE3)，經IPTG誘導后成功獲得周期蛋白 B的重組蛋白并以該重組蛋白為抗原送公司設計抗體（命名為R-CYCB）。
　　4）取經過MIH注射處理（參照組）及未經過MIH處理（實驗組）的斑節(jié)對蝦卵巢組織制備石