山羊排卵卵泡與從屬卵泡中差異表達miRNAs的篩選及其功能研究.pdf

1、卵泡排卵是有著諸多因子參與調(diào)控的生殖生理過程，它決定著母畜的排卵數(shù)，影響著母畜的繁殖性能。微小RNA（mircoRNA，或miRNA）是內(nèi)源性非編碼小分子RNA，研究發(fā)現(xiàn)miRNA對卵泡的生長發(fā)育、閉鎖和黃體形成與消失等過程均有著重要作用，但在卵泡排卵上的研究報道還相對較少。本試驗以大足黑山羊的排卵卵泡與從屬卵泡為實驗材料，通過Illumina測序、生物信息學分析及qPCR表達驗證等方法，來篩選與卵泡發(fā)育及排卵有關的miRNAs。主要實

2、驗結果如下：
　　1、將大足黑山羊卵泡期卵泡按直徑大小分為六組（GF1~GF6），對其進行sRNA高通量測序，平均得到了12,069,414拷貝的原始序列及11,876,770拷貝的干凈序列。其中長度在22nt的sRNA序列平均占干凈序列的45%，通過將其在參考物種山羊基因組上的定位與miRBase數(shù)據(jù)庫（21.0版本）的比對，共獲得418個已知miRNAs序列。同時，利用miREvo及mirdeep等miRNA預測軟件預測到11

3、0個新的miRNAs序列。
　　2、將GF1~GF6的六組卵泡分為排卵卵泡組（GF_d）和從屬卵泡組（GF_s）進行表達差異分析，結果發(fā)現(xiàn)9個miRNAs存在差異（P＜0.01），其中4個miRNAs（chi-miR-582-5p、novel_130、chi-miR-214-3p及chi-miR-500-5p）在GF_d組中表達上調(diào)，而5個miRNAs（chi-miR-383、chi-miR-130b-5p、chi-miR-92a

4、-3p、chi-miR-125b-5p及novel-9）表達下調(diào)。為篩選更多差異表達miRNAs，本試驗對六組卵泡進行組內(nèi)差異分析，發(fā)現(xiàn)novel-344、chi-miR-10a-5p、chi-miR-10a-3p及chi-miR-196b在GF1中表達上調(diào)（P＜0.01）。
　　3、利用miRanda軟件及富集通路分析發(fā)現(xiàn)，在上述13個顯著差異表達miRNAs中，其預測靶基因富集到卵巢激素合成通路（chx04913）的有chi-

5、miR-130b-5p、chi-miR-214-3p、novel-344及chi-miR-10a-5p。其中，在排卵卵泡組與從屬卵泡組中差異表達的chi-miR-130b-5p及chi-miR-214-3p靶向于BMP15、GDF9、CYP19A1和LHR基因。同時，novel-344和chi-miR-10a-5p與在顆粒細胞與膜細胞中表達的FSHR、GDF9、IGF1R、17β-HSD和LHR基因的mRNA3’UTR序列有結合位點。<

6、br>　　4、對同批次GF_d和GF_s樣品進行轉錄組測序，結果發(fā)現(xiàn)上述預測靶基因BMP15、CYP1A1、17β-HSD、IGF1R和LHR在GF_d中均表達上調(diào)，而GDF9和FSHR表達下調(diào)。其中，BMP15與chi-miR-130b-5p、FSHR與novel-344以及GDF9與chi-miR-214-3p和chi-miR-10a-5p的上下調(diào)表達模式相反，符合miRNAs的一般調(diào)控特征。
　　5、選取差異表達的6個miR

7、NAs（chi-miR-200a、chi-miR-34c-5p、chi-miR-10a-3p、chi-miR-10a-5p、novel-344和 chi-miR-196b）及3個 mRNA（BMP15、GDF9和BMP6）進行qPCR表達鑒定，實驗結果與Illumina測序分析中得到的表達模式一致。
　　本試驗篩選出了山羊排卵卵泡與從屬卵泡中差異表達的miRNAs，這些miRNAs與其預測的靶基因可能參與卵泡中的激素合成過程，從而