二花臉和大白豬排卵前卵泡差異表達(dá)的mir-331-的功能初步研究.pdf

1、miRNA是一類(lèi)非編碼的小RNA分子，平均21個(gè)核苷酸大小，通過(guò)抑制mRNA翻譯或直接降解mRNA，來(lái)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。據(jù)報(bào)道，miRNA在基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控卵巢發(fā)育，在卵泡發(fā)育、黃體成熟過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。本研究通過(guò)對(duì)二花臉和大白豬卵泡組織Solexa測(cè)序結(jié)果比對(duì)分析，獲得了在兩個(gè)豬種中差異表達(dá)miR-331*。通過(guò)對(duì)miR-331*進(jìn)行序列分析、靶基因預(yù)測(cè)、功能分析以及根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道，預(yù)測(cè)出線(xiàn)粒體基因細(xì)胞色素B（Cytochrome

2、 B，CYTB）可能是miR-331*的靶基因。線(xiàn)粒體存在于大部分真核細(xì)胞中，不僅是細(xì)胞的供能中心，而且還參與細(xì)胞代謝、細(xì)胞程序性死亡、細(xì)胞分化等重要的生命過(guò)程。本課題通過(guò)研究miR-331*及其靶基因在母豬排卵過(guò)程中發(fā)揮的調(diào)控作用及機(jī)制，為提高母豬繁殖性能提供理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:
　　1.miR-331*與其靶基因CYTB靶向關(guān)系的驗(yàn)證
　　構(gòu)建包含有miR-331*結(jié)合位點(diǎn)的pmirGLO-CYTB-WT雙熒光素

3、酶報(bào)告載體和含有miR-331*結(jié)合位點(diǎn)的pmirGLO-CYTB-mut雙熒光素酶報(bào)告載體。分別將miR-331*mimics和雙熒光素酶報(bào)告載體共轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，測(cè)定熒光活性，結(jié)果表明miR-331*能與CYTB基因結(jié)合。
　　實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)細(xì)胞中CYTB mRNA的表達(dá)量。結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，miR-331*mimic能上調(diào)CYTB mRNA的表達(dá)量。Western Blotting的結(jié)果表明:miR-331*mim

4、ic能上調(diào)CYTB蛋白的表達(dá)。CYTB-siRNA能抑制CYTB蛋白的表達(dá)。
　　2.miR-331*與其靶基因CYTB功能的研究
　　通過(guò)MTT法檢測(cè)CHO細(xì)胞在不同時(shí)間段(24h，48h，96h)的細(xì)胞增殖情況。結(jié)果顯示，超表達(dá)miR-331*，在不同時(shí)間段(24h，48h，96h)細(xì)胞增殖程度均有顯著的下降;抑制CYTB表達(dá)后，細(xì)胞增殖下降不顯著。這說(shuō)明CYTB基因抑制細(xì)胞增殖。通過(guò)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)它們對(duì)CHO細(xì)胞凋亡

5、的影響。超表達(dá)miR-331*后，細(xì)胞早期凋亡百分比相對(duì)NC組呈上升趨勢(shì);抑制CYTB表達(dá)后，細(xì)胞早期凋亡百分比相對(duì)NC組呈降低趨勢(shì)。這說(shuō)明CYTB基因促進(jìn)CHO細(xì)胞凋亡。超表達(dá)miR-331*后CHO細(xì)胞凋亡蛋白Bax的表達(dá)量隨之增加，而B(niǎo)cl-2蛋白質(zhì)的表達(dá)量則差異不顯著;抑制CYTB表達(dá)后，CHO凋亡蛋白Bax的表達(dá)量降低，而B(niǎo)cl-2蛋白質(zhì)的表達(dá)量則增加，這與前面細(xì)胞凋亡指數(shù)的結(jié)果是相符合的。
　　通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)CHO

6、細(xì)胞的周期:超表達(dá)miR-331*后CHO細(xì)胞周期G1期顯著增長(zhǎng)，S期顯著縮短;抑制CYTB表達(dá)后，CHO細(xì)胞周期G1期顯著縮短，S期顯著增長(zhǎng)。通過(guò)ELISA直接檢測(cè)經(jīng)過(guò)處理后的細(xì)胞中ATP的含量，結(jié)果顯示:超表達(dá)miR-331*，CHO細(xì)胞中ATP含量顯著下降;抑制表達(dá)CYTB時(shí)，CHO細(xì)胞中的ATP含量變化不顯著。通過(guò)Western blot檢測(cè)細(xì)胞損傷蛋白H2AX的表達(dá)情況。超表達(dá)miR-331*后，CHO細(xì)胞中H2AX的表達(dá)量顯

7、著增加;抑制CYTB表達(dá)后，CHO細(xì)胞中H2AX的表達(dá)量顯著降低，說(shuō)明CYTB促進(jìn)DNA損傷。通過(guò)Western blot檢測(cè)ERK磷酸化情況。Western blot結(jié)果表明:在轉(zhuǎn)染miR-331*mimic后，ERK磷酸化相對(duì)NC組呈降低趨勢(shì);轉(zhuǎn)染CYTB-siRNA后，ERK磷酸化與NC組相比呈降低趨勢(shì)，但差異不顯著。
　　細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞漿中，激活caspase，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Caspase能滅活或下調(diào)與DNA修復(fù)