二花臉和大白豬排卵前卵泡差異表達的mir-331-的功能初步研究.pdf

1、miRNA是一類非編碼的小RNA分子，平均21個核苷酸大小，通過抑制mRNA翻譯或直接降解mRNA，來調(diào)節(jié)基因的表達。據(jù)報道，miRNA在基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控卵巢發(fā)育，在卵泡發(fā)育、黃體成熟過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。本研究通過對二花臉和大白豬卵泡組織Solexa測序結(jié)果比對分析，獲得了在兩個豬種中差異表達miR-331*。通過對miR-331*進行序列分析、靶基因預測、功能分析以及根據(jù)相關(guān)文獻的報道，預測出線粒體基因細胞色素B（Cytochrome

2、 B，CYTB）可能是miR-331*的靶基因。線粒體存在于大部分真核細胞中，不僅是細胞的供能中心，而且還參與細胞代謝、細胞程序性死亡、細胞分化等重要的生命過程。本課題通過研究miR-331*及其靶基因在母豬排卵過程中發(fā)揮的調(diào)控作用及機制，為提高母豬繁殖性能提供理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:
　　1.miR-331*與其靶基因CYTB靶向關(guān)系的驗證
　　構(gòu)建包含有miR-331*結(jié)合位點的pmirGLO-CYTB-WT雙熒光素

3、酶報告載體和含有miR-331*結(jié)合位點的pmirGLO-CYTB-mut雙熒光素酶報告載體。分別將miR-331*mimics和雙熒光素酶報告載體共轉(zhuǎn)染CHO細胞，測定熒光活性，結(jié)果表明miR-331*能與CYTB基因結(jié)合。
　　實時定量PCR檢測細胞中CYTB mRNA的表達量。結(jié)果顯示:與對照組相比，miR-331*mimic能上調(diào)CYTB mRNA的表達量。Western Blotting的結(jié)果表明:miR-331*mim

4、ic能上調(diào)CYTB蛋白的表達。CYTB-siRNA能抑制CYTB蛋白的表達。
　　2.miR-331*與其靶基因CYTB功能的研究
　　通過MTT法檢測CHO細胞在不同時間段(24h，48h，96h)的細胞增殖情況。結(jié)果顯示，超表達miR-331*，在不同時間段(24h，48h，96h)細胞增殖程度均有顯著的下降;抑制CYTB表達后，細胞增殖下降不顯著。這說明CYTB基因抑制細胞增殖。通過用流式細胞儀檢測它們對CHO細胞凋亡

5、的影響。超表達miR-331*后，細胞早期凋亡百分比相對NC組呈上升趨勢;抑制CYTB表達后，細胞早期凋亡百分比相對NC組呈降低趨勢。這說明CYTB基因促進CHO細胞凋亡。超表達miR-331*后CHO細胞凋亡蛋白Bax的表達量隨之增加，而Bcl-2蛋白質(zhì)的表達量則差異不顯著;抑制CYTB表達后，CHO凋亡蛋白Bax的表達量降低，而Bcl-2蛋白質(zhì)的表達量則增加，這與前面細胞凋亡指數(shù)的結(jié)果是相符合的。
　　通過流式細胞儀檢測CHO

6、細胞的周期:超表達miR-331*后CHO細胞周期G1期顯著增長，S期顯著縮短;抑制CYTB表達后，CHO細胞周期G1期顯著縮短，S期顯著增長。通過ELISA直接檢測經(jīng)過處理后的細胞中ATP的含量，結(jié)果顯示:超表達miR-331*，CHO細胞中ATP含量顯著下降;抑制表達CYTB時，CHO細胞中的ATP含量變化不顯著。通過Western blot檢測細胞損傷蛋白H2AX的表達情況。超表達miR-331*后，CHO細胞中H2AX的表達量顯

7、著增加;抑制CYTB表達后，CHO細胞中H2AX的表達量顯著降低，說明CYTB促進DNA損傷。通過Western blot檢測ERK磷酸化情況。Western blot結(jié)果表明:在轉(zhuǎn)染miR-331*mimic后，ERK磷酸化相對NC組呈降低趨勢;轉(zhuǎn)染CYTB-siRNA后，ERK磷酸化與NC組相比呈降低趨勢，但差異不顯著。
　　細胞色素C釋放到細胞漿中，激活caspase，從而誘導細胞凋亡。Caspase能滅活或下調(diào)與DNA修復