Alu影響基因表達及C組染色體著絲粒生物學(xué)分析.pdf

1、目的：RNA對基因表達的影響主要包括抑制和活化基因兩個方面，這些工作在數(shù)十年前就引起了生物學(xué)家的重視，近年來在RNA活化基因（RNA激活）方面的資料在不斷積累。
　　為了研究重復(fù)序列在活化基因中的作用，本研究中，使用不同組合的Alu重復(fù)序列，例如，兩個Alu基因位于同一質(zhì)粒或不同質(zhì)粒組合，正義和反義Alu組合等，穩(wěn)定或瞬時轉(zhuǎn)染HeLa細胞，觀察重復(fù)序列對EGFP報告基因表達的影響；使用生物信息學(xué)分析方法，比較人類 C組染色體著絲粒

2、與其側(cè)翼DNA序列的RNA群結(jié)合強度，研究重復(fù)序列在RNA激活中的作用，并推理RNA激活的機理。
　　方法：
　　1、報告質(zhì)粒和誘導(dǎo)質(zhì)粒的構(gòu)建
　　2、 PSI-rTetR質(zhì)粒的構(gòu)建
　　3、細胞轉(zhuǎn)染
　　包括瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,詳細方法見正文。
　　4、熱休克處理
　　5、熒光顯微鏡觀察
　　將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細胞后，在熒光顯微鏡下觀察EGFP熒光陽性細胞，并進行照相，計算EGFP表

3、達量。
　　6、流式細胞儀檢測
　　7、序列資料和軟件
　　從NCBI人類基因組數(shù)據(jù)庫中獲得序列資料，用本研究室編寫的軟件(Gene-Analyser2.0)分析7-nt序列。
　　8、計算RNA群結(jié)合強度的方法
　　RNA群結(jié)合強度的算法是基于互補的RNA和DNA越多，RNA和DNA結(jié)合的可能性越大的原理來進行計算。具體的計算方法見正文。
　　9、 Tet-on系統(tǒng)
　　構(gòu)建Mini-C1-A

4、lu-sense-sense（mini-Alu正正組合）等質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染HeLa細胞用G418穩(wěn)定篩選,再轉(zhuǎn)染PSI-rTetR質(zhì)粒，用Puro穩(wěn)定篩選。得到G418和Puro雙抗性的細胞。這些細胞加入Dox和不加Dox進行培養(yǎng)，觀察EGFP表達量。
　　10、統(tǒng)計學(xué)處理
　　組間的比較使用均值±SD和t檢驗。所有的實驗重復(fù)只少三次，P<0.05認為兩組有統(tǒng)計學(xué)差異。流式細胞儀分析圖是至少3次獨立實驗的一個代表圖。
　　結(jié)

5、果：
　　1、質(zhì)粒表達載體的構(gòu)建及鑒定本研究構(gòu)建了五類表達載體：
　　1.1、基于pEGFP-C1質(zhì)粒構(gòu)建的表達載體,為報告質(zhì)粒（Fig.1A，Table1）。
　　1.2、基于pcDNA3.1構(gòu)建的表達載體，為瞬時轉(zhuǎn)染時的誘導(dǎo)質(zhì)粒（Fig.1B， Table1）。
　　1.3、基于PSI構(gòu)建的表達載體，為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染時的誘導(dǎo)質(zhì)粒（Fig.1C，Table1）。
　　1.4、 mini-C1報告質(zhì)粒（Fig.1

6、D, Table1）。
　　1.5、 PSI-rTetR質(zhì)粒，用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染實驗（Fig.1E，Table1）。
　　2、正義Alu和反義Alu組合后活化EGFP報告基因
　　2.1、正反組合的Alu重復(fù)序列對EGFP報告基因表達的影響
　　Fig.2顯示正反組合的Alu序列在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染時活化EGFP報告基因，然而將這些質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染 HeLa細胞時，正反組合的 Alu元件沒有活化EGFP基因表達的作用。當(dāng)兩個基因位于

7、不同質(zhì)粒，不論瞬時還是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，正反組合的Alu元件均沒有明顯活化基因作用(Table4-7)。這些結(jié)果說明，Alu元件活化基因必需正反組合，必需位于同一質(zhì)粒，且必需穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。
　　2.2、 Alu同源序列對EGFP報告基因表達的影響
　　將C1-Alu-sense-AluJB-sense（ Alu正AluJB正組合）， C1-Alu-sense-AluJB-antisense（Alu正AluJB反組合）（Table1）穩(wěn)定

8、轉(zhuǎn)染HeLa細胞，F(xiàn)ig.3顯示兩個質(zhì)粒的EGFP表達量沒有明顯差異，這兩個質(zhì)粒的EGFP基因表達量顯著低于Alu正反組合的質(zhì)粒，說明組合的正義Alu和反義AluJB元件沒有顯著活化基因作用。
　　3、熱休克對EGFP報告基因表達的影響
　　將質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HeLa細胞后進行熱休克處理，培養(yǎng)不同時間，觀察EGFP報告基因的表達。Fig.4顯示熱休克使Alu正AluJB反組合質(zhì)粒的EGFP表達量顯著上升，在熱休克第2-4天達高峰

9、，然后下降，在12天回到熱休克前的水平。熱休克對Alu正反組合質(zhì)粒中的EGFP基因表達也有顯著促進作用，雖不如Alu正AluJB反質(zhì)粒表現(xiàn)明顯，但是Alu正反組合的熱休克反應(yīng)可以維持更長時間，到熱休克第20天，EGFP的表達仍然處于較高水平。
　　將其它的對照質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HeLa細胞后也進行熱休克處理，熱休克4天后測定EGFP的表達量，F(xiàn)ig.5-Fig.6的結(jié)果說明其它組合時，熱休克均沒有使這些質(zhì)粒中的 EGFP基因的表達顯著提

10、高，而且與正反組合無關(guān)。
　　4、 Tet-on系統(tǒng)實驗
　　進一步論證了正反組合的Alu序列活化EGFP報告基因的觀點(詳細實驗內(nèi)容見正文)。
　　5、C組染色體著絲粒的RNA群結(jié)合強度低
　　本研究利用生物信息學(xué)分析模擬RNA群與著絲粒序列及其側(cè)翼序列的結(jié)合強度。關(guān)于RNA群結(jié)合強度的具體計算方法見正文。Fig.8和Table8的結(jié)果顯示著絲粒序列的RNA群的結(jié)合強度明顯低于側(cè)翼序列。
　　結(jié)論：