水稻端粒及著絲粒相關(guān)序列的轉(zhuǎn)化及其功能研究.pdf

1、具有自主復(fù)制功能的真核生物染色體必須具備三大基本組成要素，即著絲粒(Centromere)、復(fù)制原點(diǎn)(Origin of replication)和端粒(Tolomere)，這三個(gè)組成要素已在一些模式生物的人工染色體構(gòu)建中得到驗(yàn)證。著絲粒既是姊妹染色單體的結(jié)合點(diǎn)，又是紡錘絲的附著點(diǎn)，因而在染色體配對(duì)及維系生物體遺傳信息穩(wěn)定傳遞中起重要作用。而端粒的序列最為簡(jiǎn)單，不同生物類型間的保守性也最強(qiáng)，不同物種之間均為TT(T)AGGG不同數(shù)量的簡(jiǎn)

2、單串聯(lián)重復(fù)序列。在功能上，端粒對(duì)于維持染色體的完整性顯得尤為重要，對(duì)于缺少端粒的染色體，它將不斷發(fā)生斷裂，因而在細(xì)胞分裂過程中不能穩(wěn)定傳遞。 水稻是重要的糧食作物，同時(shí)也是單子葉植物基因組及分子生物學(xué)研究的重要模式生物。用水稻來(lái)研究端粒及著絲粒的結(jié)構(gòu)與功能具有以下幾方面的優(yōu)點(diǎn)：1)水稻全基因組已經(jīng)測(cè)序，從而可以為端粒及著絲粒研究提供豐富的基因組信息；2)水稻染色體很小，含有的重復(fù)序列也較少，更利于與分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合，采用具有

3、很高分辨率的粗線期染色體進(jìn)行熒光原位雜交，這是具大染色體生物所無(wú)法進(jìn)行的；3)水稻的遺傳轉(zhuǎn)化比較容易，因此利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將一段端粒及著絲粒相關(guān)序列插入到水稻受體細(xì)胞中，一方面可研究該插入序列的功能，同時(shí)還可以獲得相應(yīng)的細(xì)胞學(xué)變異材料，為深入研究它們的功能提供豐富的基礎(chǔ)材料。 本研究構(gòu)建了水稻端粒和著絲粒相關(guān)DNA序列的表達(dá)載體，應(yīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將其轉(zhuǎn)化到水稻品種中，獲得了一批轉(zhuǎn)化水稻植株，主要研究結(jié)果如下： 1、秈稻的遺

4、傳轉(zhuǎn)化比粳稻難度大，為探索一套適合秈稻農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的技術(shù)體系，以秈稻品種中秈3037為材料，研究了影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化效率的幾個(gè)重要因素，結(jié)果表明：MS Ⅱ培養(yǎng)基作為愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基要好于N6D2培養(yǎng)基；以幼胚為外植體，愈傷組織的誘導(dǎo)率和轉(zhuǎn)化率明顯比成熟胚和幼穗高；根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化率要高于AGLO；當(dāng)以幼胚為外植體時(shí)，根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105介導(dǎo)的中秈3037轉(zhuǎn)化率為18.0％，而AGLO0僅為5.5％；EHA

5、105菌液OD值為0.6，浸染時(shí)間14min為中秈3037合適的轉(zhuǎn)化參數(shù)；在分化培養(yǎng)基MSR中添加20g/L的山梨醇有利于抗性愈傷組織的分化。在此基礎(chǔ)上，采用優(yōu)化的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化中秈3037及其來(lái)源的突變體A和B，獲得了轉(zhuǎn)化植株，PCR、Southern雜交和T1代遺傳分析均表明外源基因已經(jīng)整合到水稻基因組中。 2、采用優(yōu)化的農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法，將GFP-OsCENH3嵌合基因?qū)胨酒贩N中秈3037中，經(jīng)PCR及Southern

6、雜交檢測(cè)，證明該嵌合基因確已整合到水稻的基因組中。對(duì)T0及T1代轉(zhuǎn)基因水稻植株有絲分裂和減數(shù)分裂過程中GFP蛋白與水稻CENH3蛋白表達(dá)關(guān)系的研究表明，CENH3的表達(dá)部位與GFP蛋白的表達(dá)部位完全重疊，說明GFP蛋白與水稻CENH3蛋白已構(gòu)成融合蛋白，并且定位于染色體的著絲粒部位。為探索該轉(zhuǎn)基因植株在水稻遺傳及分子生物學(xué)研究中的作用，利用花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂偶線期染色體，借助水稻著絲粒串聯(lián)重復(fù)序列ContO的FISH，發(fā)現(xiàn)GFP信號(hào)與C

7、ontO信號(hào)完全重疊，證明ContO序列確實(shí)為水稻不同染色體功能性著絲粒的主要成分。利用該轉(zhuǎn)基因植株，分別制作根尖細(xì)胞有絲分裂染色體和花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂染色體制片，與anti-α-tublin微管蛋白抗體和anti-PAIR2抗體進(jìn)行熒光免疫染色反應(yīng)，表明該轉(zhuǎn)基因植株攜帶GFP標(biāo)記的著絲粒，可以與其它分子生物學(xué)手段相結(jié)合，并能在活體細(xì)胞及組織中十分方便地顯示每一染色體功能性著絲粒位置，為深入研究著絲粒功能提供了寶貴的遺傳材料。

8、3、根據(jù)水稻端粒酶基因的生物信息學(xué)分析，利用RNA干涉技術(shù)使水稻中端粒酶亞基失活，并借此來(lái)影響水稻染色體的端粒長(zhǎng)度。用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將表達(dá)載體pCam23A-1-2導(dǎo)入水稻品種日本晴中，獲得了78個(gè)轉(zhuǎn)化子，得到了165棵轉(zhuǎn)化植株。通過PCR檢測(cè)和Southern雜交分析，初步證明獲得了端粒酶亞基失活的轉(zhuǎn)基因水稻；應(yīng)用染色體末端限制片段分析法結(jié)合FISH檢測(cè)分析，顯示在端粒酶亞基失活的水稻中端粒DNA序列長(zhǎng)度有逐代縮短的趨勢(shì)，但是在轉(zhuǎn)基因水

9、稻的T0和T1代植株中其主要農(nóng)藝性狀沒有發(fā)生明顯變化。 4、應(yīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將602bp的端粒DNA序列導(dǎo)入粳稻品種武香粳9號(hào)中，獲得了652個(gè)轉(zhuǎn)化子，得到了1782棵單株，根據(jù)表型觀察、T-DNA的PCR檢測(cè)和Southern雜交結(jié)果，初步證明端粒DNA序列已經(jīng)整合到轉(zhuǎn)基因水稻中，在轉(zhuǎn)基因植株的后代中獲得了一系列突變體，其中涉及染色體變異的包括同源四倍體、非整倍體，染色體相互易位突變體等。而涉及單個(gè)基因變異的包括早熟、遲熟、矮

10、稈、低育等突變體。 5、利用農(nóng)稈菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化粳稻品種武香粳9號(hào)，產(chǎn)生T-DNA插入群體。在篩選和鑒定水稻T-DNA插入突變體的過程中，發(fā)現(xiàn)一個(gè)矮稈突變體。利用PCR擴(kuò)增、Southern雜交等分子生物學(xué)方法對(duì)該突變體后代進(jìn)行了鑒定及遺傳分析。遺傳分析表明，突變體自交后代群體中出現(xiàn)矮稈和正常株高兩種類型，分離比為3：1，符合一對(duì)顯性單基因控制的遺傳模式，并且矮稈性狀的表現(xiàn)與T-DNA插入共分離。利用秈稻品種龍?zhí)馗εc其純合矮稈植株進(jìn)