棉花顯微切割技術(shù)體系的建立及著絲粒序列探索研究.pdf

1、著絲粒結(jié)構(gòu)和功能、物理圖譜著絲粒區(qū)Gap填補等已成為當今分子細胞生物學與分子細胞遺傳學的熱點之一，而對于棉花的著絲粒的研究，至今尚未取得突破性進展。棉花是我國乃至世界最重要的纖維經(jīng)濟作物之一，對棉花著絲粒的研究，不僅有利于進一步闡明各棉種之間的遺傳進化和親緣關(guān)系，而且也會為正在進行的棉花基因組測序的序列拼接提供借鑒和幫助。本研究利用顯微切割技術(shù)及PCR擴增技術(shù)，探尋棉花的著絲粒序列，主要研究結(jié)果如下：
　　 1．棉花染色體或染色

2、體片段微分離及LA-PCR技術(shù)體系的建立。采用前低滲、酶解、后低滲和壓片相結(jié)合的方法獲得適于切割的中期染色體膜制片，進而形成一套行之有效的單染色體或染色體片段的切割流程。對切割獲得的目標染色體或片段，利用LA-PCR進行擴增，這樣可以大大減少對目標染色體或片段的收集。擴增后，通過FSIH驗證，形成了完整的驗證體系。建立了一套高效、快捷、易于操作的棉花染色體片段微分離技術(shù)體系。
　　 2．切割的亞洲棉著絲粒區(qū)域片段經(jīng)LA-PCR擴

3、增后，著絲粒片段并未被克隆出來，分析原因可能有兩點：一是棉花染色體小，在激光灼燒過程中對著絲點部分形成損傷，沒有獲得棉花著絲粒的DNA序列；二是棉屬著絲粒序列中可能不含Sau3A酶切位點，不能有效的擴增其DNA序列。具體是以上哪種原因引起的，我們還需做進一步驗證。
　　 3．對石系亞1號第5號單染色體擴增后產(chǎn)物進行FISH驗證，信號分布于亞洲棉所有染色體上，而其中有兩條染色體的雜交信號較強。用第5號染色體的特異BAC87P01與

4、擴增產(chǎn)物進行雙色FISH驗證，發(fā)現(xiàn)BAC87P01信號與擴增產(chǎn)物產(chǎn)生的較強的信號位于同一染色體上。
　　 4．利用擬南芥的著絲粒序列(Cenl，Cen2)和逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子序列(CR1，CR2)設計的4對引物分別對亞洲棉基因組DNA和雷蒙德氏棉基因組DNA進行擴增，只有Cenl引物擴增出產(chǎn)物，進過FISH驗證，所擴增的產(chǎn)物在亞洲棉和雷蒙德氏棉上均不產(chǎn)生信號，這可能是因為擬南芥著絲粒序列及逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子序列與棉屬的著絲粒序列具有極低或不

5、具有同源性。
　　 5．以海島棉部分gypsp逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子序列設計兩對引物(K201，K202)，這兩對引物均在亞洲棉基因組DNA和雷蒙德氏棉基因組DNA擴增出產(chǎn)物，F(xiàn)ISH驗證結(jié)果顯示，只有K202引物擴增的產(chǎn)物在亞洲棉染色體上產(chǎn)生信號，信號位于端粒附近。對K202擴增的序列進行分別驗證，發(fā)現(xiàn)端粒附近的信號由818bp的片段所產(chǎn)生。對818bp的序列進行測序，序列比對發(fā)現(xiàn)，它與gypsp類的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子有94％的同源性，與陸地