棉花顯微切割技術(shù)體系的建立及著絲粒序列探索研究.pdf

1、著絲粒結(jié)構(gòu)和功能、物理圖譜著絲粒區(qū)Gap填補(bǔ)等已成為當(dāng)今分子細(xì)胞生物學(xué)與分子細(xì)胞遺傳學(xué)的熱點(diǎn)之一，而對(duì)于棉花的著絲粒的研究，至今尚未取得突破性進(jìn)展。棉花是我國(guó)乃至世界最重要的纖維經(jīng)濟(jì)作物之一，對(duì)棉花著絲粒的研究，不僅有利于進(jìn)一步闡明各棉種之間的遺傳進(jìn)化和親緣關(guān)系，而且也會(huì)為正在進(jìn)行的棉花基因組測(cè)序的序列拼接提供借鑒和幫助。本研究利用顯微切割技術(shù)及PCR擴(kuò)增技術(shù)，探尋棉花的著絲粒序列，主要研究結(jié)果如下：
　　 1．棉花染色體或染色

2、體片段微分離及LA-PCR技術(shù)體系的建立。采用前低滲、酶解、后低滲和壓片相結(jié)合的方法獲得適于切割的中期染色體膜制片，進(jìn)而形成一套行之有效的單染色體或染色體片段的切割流程。對(duì)切割獲得的目標(biāo)染色體或片段，利用LA-PCR進(jìn)行擴(kuò)增，這樣可以大大減少對(duì)目標(biāo)染色體或片段的收集。擴(kuò)增后，通過(guò)FSIH驗(yàn)證，形成了完整的驗(yàn)證體系。建立了一套高效、快捷、易于操作的棉花染色體片段微分離技術(shù)體系。
　　 2．切割的亞洲棉著絲粒區(qū)域片段經(jīng)LA-PCR擴(kuò)

3、增后，著絲粒片段并未被克隆出來(lái)，分析原因可能有兩點(diǎn)：一是棉花染色體小，在激光灼燒過(guò)程中對(duì)著絲點(diǎn)部分形成損傷，沒(méi)有獲得棉花著絲粒的DNA序列；二是棉屬著絲粒序列中可能不含Sau3A酶切位點(diǎn)，不能有效的擴(kuò)增其DNA序列。具體是以上哪種原因引起的，我們還需做進(jìn)一步驗(yàn)證。
　　 3．對(duì)石系亞1號(hào)第5號(hào)單染色體擴(kuò)增后產(chǎn)物進(jìn)行FISH驗(yàn)證，信號(hào)分布于亞洲棉所有染色體上，而其中有兩條染色體的雜交信號(hào)較強(qiáng)。用第5號(hào)染色體的特異BAC87P01與

4、擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙色FISH驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)BAC87P01信號(hào)與擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生的較強(qiáng)的信號(hào)位于同一染色體上。
　　 4．利用擬南芥的著絲粒序列(Cenl，Cen2)和逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子序列(CR1，CR2)設(shè)計(jì)的4對(duì)引物分別對(duì)亞洲棉基因組DNA和雷蒙德氏棉基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，只有Cenl引物擴(kuò)增出產(chǎn)物，進(jìn)過(guò)FISH驗(yàn)證，所擴(kuò)增的產(chǎn)物在亞洲棉和雷蒙德氏棉上均不產(chǎn)生信號(hào)，這可能是因?yàn)閿M南芥著絲粒序列及逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子序列與棉屬的著絲粒序列具有極低或不

5、具有同源性。
　　 5．以海島棉部分gypsp逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子序列設(shè)計(jì)兩對(duì)引物(K201，K202)，這兩對(duì)引物均在亞洲棉基因組DNA和雷蒙德氏棉基因組DNA擴(kuò)增出產(chǎn)物，F(xiàn)ISH驗(yàn)證結(jié)果顯示，只有K202引物擴(kuò)增的產(chǎn)物在亞洲棉染色體上產(chǎn)生信號(hào)，信號(hào)位于端粒附近。對(duì)K202擴(kuò)增的序列進(jìn)行分別驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)端粒附近的信號(hào)由818bp的片段所產(chǎn)生。對(duì)818bp的序列進(jìn)行測(cè)序，序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，它與gypsp類的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子有94％的同源性，與陸地