三氧化二砷誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞自噬與凋亡的機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　本課題以人肝癌細(xì)胞株HepG2、 SMMC-7721為研究對(duì)象，并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建人肝癌細(xì)胞荷瘤裸鼠模型，主要從細(xì)胞增殖、自噬和凋亡等方面研究三氧化二砷在體內(nèi)外對(duì)肝癌細(xì)胞作用的內(nèi)在機(jī)制，以期為肝癌綜合治療模式提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和新的思路。
　　方法:
　　1.MTT法檢測(cè)不同濃度（0μM、1μM、2μM、5μM、10μM、15μM、20μM、25μM）As2O3對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞作用不同時(shí)間(24h、48h、72

2、h)增殖抑制的影響。
　　2.倒置相差顯微鏡觀察不同濃度（0μM、5μM、10μM、15μM）As2O3作用肝癌HepG2細(xì)胞24h形態(tài)學(xué)的變化。
　　3.Hoechst33258染色法檢測(cè)不同濃度（0μM、5μM、10μM、15μM）As2O3作用肝癌HepG2細(xì)胞24h凋亡形態(tài)變化的影響。
　　4.TUNEL法檢測(cè)As2O315μM作用肝癌HepG2細(xì)胞24h凋亡形態(tài)變化的影響。
　　5.Annexin V-

3、FIFC/PI雙染法檢測(cè)As2O315μM作用肝癌HepG2細(xì)胞24h凋亡的影響。
　　6.透射電子顯微鏡觀察As2O315μM作用肝癌HepG2細(xì)胞24h對(duì)細(xì)胞凋亡和自噬的影響。
　　7.免疫熒光檢測(cè)As2O315μM作用肝癌HepG2細(xì)胞24h后自噬蛋白LC3 A/B、Beclin1的表達(dá)情況。
　　8.Western Blot分別檢測(cè)不同濃度（0μM、5μM、10μM、15μM）As2O3作用肝癌HepG2細(xì)胞2

4、4h及As2O315μM作用肝癌HepG2細(xì)胞不同時(shí)間(0h、2h、4h、8h、12h、24h)后LC3 A/B、p62蛋白表達(dá)水平的變化。
　　9.Western Blot分別檢測(cè)不同濃度（0μM、5μM、10μM、15μM）As2O3作用肝癌HepG2細(xì)胞24h及As2O315μM作用肝癌HepG2細(xì)胞不同時(shí)間(0h、2h、4h、8h、12h、24h)后P-JNK、JNK、P-p38、p38、P-Akt、Akt、P-mTOR、

5、mTOR、Caspase-3、Caspase-7、Caspase-8、Caspase-9、PARP、p27蛋白表達(dá)水平的變化。
　　10.Western Blot檢測(cè)PI3K/Akt抑制劑LY294002預(yù)處理后P-Akt、Akt、LC3 A/B、p62蛋白表達(dá)水平的變化。
　　11.Western Blot檢測(cè)PI3K抑制劑3-MA預(yù)處理后LC3 A/B、p62、Caspase-3、P-JNK、JNK、P-p38、p38蛋

6、白表達(dá)水平的變化。
　　12.BALB/C裸鼠18只，右下肢腋部皮下接種人肝癌SMMC-7721細(xì)胞，建立人肝癌荷瘤裸鼠模型。
　　13.成瘤后隨機(jī)分為陰性對(duì)照（0.9％氯化鈉注射液）組、As2O3低劑量[2mg/（kg·d）]組、As2O3高劑量[4mg/(kg·d)]組，腹腔注射0.2 mL/d，連續(xù)2周。每隔3天測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑(a)和短徑(b)，按公式V=ab2/2計(jì)算腫瘤體積。停藥后1天處死剝瘤記錄，并計(jì)算抑瘤率。<

7、br>　　14.采集腫瘤組織標(biāo)本，HE染色觀察形態(tài)結(jié)構(gòu)。
　　15.TUNEL法檢測(cè)As2O3對(duì)裸鼠移植瘤細(xì)胞凋亡的影響。
　　結(jié)果:
　　1.同一時(shí)間內(nèi)，隨著As2O3作用濃度升高，其對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞的增殖抑制率逐漸增加。與對(duì)照組相比，除24h時(shí)間段的As2O31μM、2μM、5μM組，48h時(shí)間段的As2O31μM、5μM組外，其余均有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);同一濃度內(nèi)，As2O31μM、2μM組除外

8、，隨著As2O3作用時(shí)間延長(zhǎng)，其對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高。與對(duì)照組相比，除As2O31μM的24h、48h時(shí)間段，As2O32μM、5μM的24h時(shí)間段，其余均有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　2.不同濃度As2O3作用24h后倒置相差顯微鏡觀察肝癌HepG2細(xì)胞的形態(tài)變化，鏡下可見(jiàn):與Control組相比，As2O3處理組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)不良，輪廓增強(qiáng)，細(xì)胞變得不規(guī)則，隨著藥物濃度升高，情況進(jìn)一步嚴(yán)重，甚至出現(xiàn)

9、細(xì)胞漂浮，失去原有特點(diǎn)。
　　3.不同濃度As2O3作用肝癌HepG2細(xì)胞24h后，Hoechst33258染色結(jié)果顯示:隨著藥物濃度升高，As2O3處理組與Control組相比，細(xì)胞核呈現(xiàn)致密濃染，亮藍(lán)色熒光強(qiáng)度也逐漸變強(qiáng)。
　　4.As2O315μM作用肝癌HepG2細(xì)胞24h后，TUNEL法檢測(cè)結(jié)果顯示:Control組只可見(jiàn)極少數(shù)綠色熒光，而As2O315μM組鏡下觀察到大量的綠色熒光的凋亡細(xì)胞。
　　5.As

10、2O315μM作用肝癌HepG2細(xì)胞24h后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示:與Control組相比，As2O315μM組早期和晚期凋亡細(xì)胞百分比顯著增加。
　　6.As2O315μM作用肝癌HepG2細(xì)胞24h后，透射電子顯微鏡觀察可見(jiàn):與Control組相比，As2O315μM組絨毛減少，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)顆粒減少，線粒體腫脹變形，核染色質(zhì)邊集，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)“空泡化”現(xiàn)象;部分胞漿內(nèi)出現(xiàn)大量雙層及多層膜的自噬泡結(jié)構(gòu)，部分溶酶體染色加深，一些區(qū)域

11、還出現(xiàn)了自噬溶酶體結(jié)構(gòu)。
　　7.As2O315μM作用肝癌HepG2細(xì)胞24h后，免疫熒光檢測(cè)LC3 A/B和Beclin1的表達(dá)情況。激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察可見(jiàn):As2O315μM組中均有Beclin1和LC3 A/B表達(dá)，與Control組相比表達(dá)量顯著增多。
　　8.不同濃度As2O3作用肝癌HepG2細(xì)胞24h后，Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示:隨著藥物濃度升高，LC3 A/B蛋白表達(dá)逐漸升高，p62蛋白

12、表達(dá)逐漸降低;As2O315μM作用肝癌HepG2細(xì)胞不同時(shí)間后，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，LC3 A/B蛋白表達(dá)逐漸升高，p62蛋白表達(dá)逐漸降低。
　　9.不同濃度As2O3作用肝癌HepG2細(xì)胞24h后，Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示:隨著藥物濃度升高，P-JNK、P-p38蛋白表達(dá)水平逐漸升高，Caspase-3、Caspase-7、Caspase-8、Caspase-9、PARP、P-Akt、P-mTOR表達(dá)水平逐漸降低，

13、總量JNK、p38、Akt、mTOR變化不大。As2O315μM作用肝癌HepG2細(xì)胞不同時(shí)間后，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，p27表達(dá)水平逐漸升高，P-Akt、Caspase-7、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-3表達(dá)水平逐漸降低，總量Akt變化不大。
　　10.PI3 K/Akt抑制劑LY294002預(yù)處理后，Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示:LY294002可顯著抑制Akt磷酸化，與As2O3聯(lián)合處理后可

14、明顯提高LC3 A/B蛋白表達(dá)水平，減少p62蛋白表達(dá)量。
　　11.PI3K抑制劑3-MA預(yù)處理后，Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示:3-MA抑制自噬后，As2O3聯(lián)合3-MA組與As2O3單獨(dú)處理組相比，LC3 A/B蛋白表達(dá)水平降低，p62蛋白表達(dá)水平升高;與Control組相比，As2O3聯(lián)合3-MA組Caspase-3表達(dá)水平降低，但高于As2O3單獨(dú)處理組;與As2O3單獨(dú)處理組相比，As2O3聯(lián)合3-MA組P-J

15、NK、P-p38蛋白表達(dá)量明顯減少，總量JNK、p38變化不大。
　　12.18只裸鼠造模成功，As2O3干預(yù)治療2周后，生理鹽水組裸鼠明顯消瘦，活動(dòng)能力下降;與生理鹽水組相比，As2O3處理組進(jìn)食和飲水等減少不明顯，精神活動(dòng)尚可。其中As2O3高劑量組2號(hào)裸鼠干預(yù)第10天不明原因死亡。
　　13.As2O3對(duì)人肝癌SMMC-7721裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)的影響:As2O3低劑量組和As2O3高劑量組瘤體積抑制率分別為23.24

16、％和37.90％。與生理鹽水組相比，As2O3高劑量組平均瘤體積變化值具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　14.腫瘤切片后進(jìn)行HE染色，鏡下觀察可見(jiàn):生理鹽水組腫瘤組織細(xì)胞多呈團(tuán)灶狀分布，組織結(jié)構(gòu)尚可;As2O3低劑量組細(xì)胞體積變小，部分區(qū)域腫瘤組織可見(jiàn)凋亡現(xiàn)象;As2O3高劑量組出現(xiàn)細(xì)胞核深染、核固縮，正常結(jié)構(gòu)消失，其間見(jiàn)大片狀壞死灶。
　　15.As2O3對(duì)人肝癌裸鼠移植瘤細(xì)胞凋亡的影響:TUNEL染色結(jié)果顯示:鏡下觀

17、察細(xì)胞核出現(xiàn)塊狀棕黃色或棕褐色為陽(yáng)性表達(dá)，陰性對(duì)照則無(wú)結(jié)果。與生理鹽水組相比，As2O3低、高劑量組陽(yáng)性細(xì)胞比例增多，染色程度逐漸變深，呈棕色沉淀，多為弱陽(yáng)性或陽(yáng)性。
　　結(jié)論:
　　1.As2O3在一定濃度范圍內(nèi)能夠抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖，且此抑制作用具有一定的劑量和時(shí)間依賴性。
　　2.As2O3能夠誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與MAPK信號(hào)通路、PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路、caspase依賴