Tim-3阻斷蛋白及抗體的功能評價和作用機制研究.pdf

1、背景：Tim-3屬于T細胞免疫球蛋白及黏蛋白家族（T cell immunoglobulin domain and mucin domain protein Tims），2002年Tim-3首次發(fā)現于活化的Th1細胞表面。半乳凝素-9（Galectin-9,Gal-9）是Tim-3的配體，廣泛表達于多種細胞，Tim-3與其配體結合可顯著抑制T細胞的活化和增殖，維持體內免疫耐受。近年來發(fā)現Tim-3也表達于天然免疫細胞如巨噬細胞、單核細胞

2、、NK細胞、DC細胞等。各類感染性疾病嚴重危害患者的生命健康。病毒在感染過程中演化出了一系列的機制抵抗宿主的免疫應答，例如流感病毒能夠通過抑制抗病毒免疫效應分子Ⅰ型干擾素（TypeⅠInterferon）的產生而拮抗宿主的抗病毒反應，從而對人畜共患極具危險性。臨床研究表明，H7N9感染患者T細胞表面Tim-3表達上調，并且伴有干擾素表達水平的下調[1]；動物實驗表明，小鼠感染流感病毒后，肺部的Tim-3表達明顯升高。鑒于Tim-3與免疫

3、耐受的關系，阻斷Tim-3通路是否增強免疫細胞的抗病毒免疫反應等目前尚不清楚，且是非常值得探討的課題。Tim-3在免疫相關性疾病臨床治療中的應用前景越來越受到人們的重視，但目前尚沒有成熟的干預藥物問世。我們實驗室在前期制備了能阻斷Tim-3與其配體結合的制劑重組人Tim-3-Fc融合蛋白的基礎上（已經申請獲得國家發(fā)明專利），對該融合蛋白的功能進行了進一步的評價，同時本研究還制備了抗人Tim-3抗體，期望能為研發(fā)以Tim-3為靶點的生物藥

4、物奠定基礎。
　　目的：在前期制備重組人Tim-3-Fc融合蛋白的基礎上，評價其生物學活性，并進一步制備抗人Tim-3抗體，利用細胞及體外感染模型系統(tǒng)評價Tim-3-Fc融合蛋白及Tim-3抗體在阻斷Tim-3生物學功能中的作用，并初步探究其作用的機制，明確將其用作Tim-3干預藥物的可行性。
　　方法：⑴基于Tim-3融合蛋白可以競爭性阻斷Tim-3與其配體的結合，以表達Tim-3的巨噬細胞系、淋巴細胞系以及人外周血細胞為

5、模型，利用ELISA以及Real-time PCR的方法觀察其中炎性因子水平的變化（包括IL-8、IL-2和IFN-γ）以及Ⅰ型干擾素的表達，驗證其體外活性。⑵運用制備的人重組Tim-3蛋白，按照常規(guī)方法免疫BALB/c小鼠，篩選出陽性克隆，并將陽性雜交瘤細胞打回小鼠體內，抽取腹水并進行純化制備抗體；⑶鑒定制備的Tim-3單抗的結合特異性；⑷對所制備的單克隆抗體的中和活性進行驗證：基于Tim-3抗體可以競爭性結合Tim-3從而阻斷其與配

6、體的結合，以表達Tim-3的巨噬細胞系以及人外周血細胞為模型利用ELISA和Real-time PCR的方法檢測其中炎性因子及Ⅰ型干擾素的變化；⑸利用人PBMC建立H1N1病毒感染的體外模型，使用Real-time PCR方法測定Tim-3表達量的變化，然后使用Tim-3單抗進行干預，檢測病毒載量及Ⅰ型干擾素變化情況，初步探討其在抗病毒免疫中的作用機制。
　　結果：①鑒定了實驗室前期制備的重組人Tim-3-Fc融合蛋白的結合活性，

7、發(fā)現其能競爭性的阻斷巨噬細胞等細胞表面Tim-3與其配體的結合，增加炎性因子IL-8、IL-2、IFN-γ以及Ⅰ型干擾素的分泌。②抗人Tim-3單克隆抗體制備及鑒定：獲得了一株能夠分泌具有較好活性的抗人Tim-3單克隆抗體細胞株（克隆號L3G)，其分泌的免疫球蛋白亞型為IgG2a；流式結果表明，該抗體能夠結合人巨噬細胞系U937和Jurkat細胞表面的Tim-3分子以及外源轉入細胞的Tim-3分子，ELISA結果也表明其可與人Tim-3

8、融合蛋白特異性結合，但流式結果表明，L3G抗體不與小鼠來源的巨噬細胞系（RAW264.7）表面的Tim-3結合，說明其結合活性具有種屬特異性；該抗體能夠阻斷人巨噬細胞系以及外周血細胞中Tim-3的信號，增加炎性因子以及Ⅰ型干擾素的分泌；在H1N1病毒感染的體外模型中，發(fā)現隨著感染時間的延長Tim-3表達也呈上升趨勢，當加入L3G抗體進行阻斷后，病毒載量有所下降，并且Ⅰ型干擾素的表達上調，提示其具有一定的增強病毒免疫的作用。
　　結