Tim-3在慢性HBV感染介導的CD8+T細胞耗竭中的作用及其負調控機制的研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(HepatitisBVirus，HBV)基因組長3.2kb，為部分雙鏈環(huán)狀DNA。成人感染乙型肝炎病毒后約有5％發(fā)展成慢性感染，而慢性乙型肝炎(chronichepatitisB,CHB)是肝硬化和肝癌的主要原因。乙肝病毒感染的過程中，病毒本身并不會直接引起肝細胞的損傷，宿主的抗病毒免疫應答導致的肝細胞損傷是各種肝臟疾病發(fā)生的重要機制。有文獻報道，CD8+T細胞通過直接對HBV感染肝細胞的殺傷作用及分泌抗病毒細胞因子兩種機

2、制來清除病毒。在慢性HBV感染過程中，病毒特異性CD8+T細胞耗竭及其免疫功能失調（弱應答或者不應答）是病毒持續(xù)存在的重要原因，但是其分子機制尚不清楚。
　　 T細胞免疫球蛋白粘蛋白(Tcellimmunoglobulindomainandmucindomainprotein,Tim)基因家族是2001年發(fā)現(xiàn)的新型免疫調節(jié)基因家族。人類Tim家族定位于5q33.2，該家族包括3個成員Tim-1，Tim-3和Tim-4。人Tim-

3、3分子最初是作為Th1細胞的特異性表面標記被克隆的，其編碼蛋白由胞外段（含181個氨基酸）、跨膜區(qū)（含21個氨基酸）和胞內(nèi)區(qū)（含78個氨基酸）組成。大量研究表明，Tim-3分子在多種免疫細胞如自然殺傷細胞(naturalkillercell，NKcell)，樹突狀細胞(Dentriticcell，DC)，CD8+T細胞，Th17細胞，單核/巨噬細胞(monocyte/macrophage)表面均有表達。Tim-3與其配體galectin

4、-9結合介導Th1細胞凋亡及免疫耐受的形成，從而負向調節(jié)Th1型免疫應答，在多種自身免疫性疾病如NOD(non-obesediabetic)，EAE(experimentalautoimmuneencephalomyelitis)小鼠模型中發(fā)揮重要作用。近期有研究報道，Tim-3通過抑制CD8+T細胞的應答參與人類免疫缺陷病毒（humanimmunodeficiencyvirus，HIV）及丙型肝炎病毒(HepatitisCviurs，

5、HCV)感染。本課題組前期研究證實Tim-3通過抑制NK細胞功能參與慢乙肝的發(fā)生。但在慢乙肝的發(fā)病過程中，Tim-3是否影響CD8+T細胞的功能尚未見報道。
　　 本課題利用臨床標本及體外細胞實驗研究Tim-3在慢乙肝患者外周血CD8+T細胞表面的表達及其與臨床指標相關性，進而通過體外共培養(yǎng)及功能阻斷實驗研究Tim-3在慢乙肝患者CD8+T細胞功能失調中的作用及其機制，為慢乙肝發(fā)病機制的研究及疾病的治療提供新的實驗依據(jù)。

6、　　 第一部分慢乙肝病人外周血CD8+T細胞Tim-3表達顯著升高，并介導病毒特異性CD8+T細胞耗竭
　　 Tim-3表達于多種免疫細胞并通過多種途徑調節(jié)固有免疫及適應性免疫應答。CD8+T細胞是機體抗病毒的主要免疫效應細胞，其數(shù)量和質量在慢乙肝的轉歸中起著非常重要的作用。已有研究表明，Tim-3通過抑制CD8+T細胞功能參與HW及HCV慢性感染，但Tim-3是否調節(jié)慢乙肝病人CD8+T細胞功能并介導CD8+T細胞耗竭，迄今

7、尚未見報道。本研究首先檢測了慢乙肝病人及正常人外周血CD8+T細胞表面Tim-3的表達。
　　 1.慢乙肝病人外周血CD8+T細胞Tim-3表達明顯升高，且Tim-3表達與HBV感染相關
　　 收集56例慢乙肝患者，34例健康志愿者作為對照。流式細胞術檢測外周血單個核細胞(peripheralbloodmononuclearcells，PBMC)中CD8+T細胞Tim-3的表達。結果顯示:慢乙肝患者外周血CD8+T細胞中

8、Tim-3陽性細胞的百分比(p=0.0008)及平均熒光強度(MFI)(p=0.0005)均明顯高于健康志愿者，且HBeAg陽性的慢乙肝患者外周血CD8+T細胞表面Tim-3表達明顯高于HBeAg陰性患者(p=0.0074)。進一步統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn)，CD8+T細胞表面Tim-3的表達水平與患者血清HBV-DNA滴度呈正相關(r=0.3139，P=0.0298)。
　　 2.與Tim-3陰性群相比，慢乙肝患者外周血Tim-3陽性CD

9、8+T細胞表現(xiàn)為活化但功能抑制的表型
　　 本研究收集28例慢乙肝病人及12例健康志愿者外周血，流式檢測CD3+CD8+T細胞CD28及Tim-3表達，結果顯示:與健康對照組相比，CHB患者CD8+T細胞中Tim-3的表達上調主要表現(xiàn)在CD8+CD28+T細胞群(p=0.0233)而不是CD8+CD28-Ts群(p=0.2072)。為了進一步研究Tim-3表達對CD8+T細胞的影響，本研究通過標記Tim-3流式抗體將CD8+T細

10、胞分為Tim-3陽性群和Tim-3陰性群，流式表型分析發(fā)現(xiàn)，Tim-3陽性群CD8+T細胞表面活化標記CD69的表達明顯增加(p=0.0072)，但顆粒酶(p=0.8430)和穿孔素(p=0.3984)的表達在Tim-3陽性群及陰性群中沒有明顯差異。結果提示CHB患者Tim-3陽性的CD8+T細胞是活化但功能受抑制的CD8+T細胞。
　　 3.Tim-3顯著抑制CHB患者CD8+T細胞增殖及其IFN-γ分泌
　　 3.1

11、CHB患者外周Tim-3+CD8+T細胞HBV抗原特異性反應能力降低
　　 為研究Tim-3對CD8+T細胞功能的影響，本研究分離CHB患者外周PBMC，HBs抗原肽刺激后，流式細胞術比較Tim-3+CD8+T細胞及Tim-3-CD8+T細胞功能。結果顯示，HBs抗原肽刺激6h，Tim-3陽性CD8+T細胞IFN-γ表達低于Tim-3陰性群，但沒有顯著性差異(p=0.1823)。CFSE染色及流式細胞術分析結果顯示，HBs抗原肽

12、刺激4天，Tim-3陽性CD8+T細胞群的增殖明顯弱于Tim-3陰性群(p=0.0251)。再次提示Tim-3表達升高與CHB患者抗原特異性CD8+T細胞的功能抑制相關。
　　 3.2阻斷Tim-3途徑明顯增強CHB患者CD8+T細胞功能
　　 為了進一步研究Tim-3對CD8+T細胞功能的影響，本研究分離慢乙肝患者PBMC，利用Tim-3-Fc融合蛋白阻斷Tim-3信號途徑（IgG作為對照）后，HBs抗原肽刺激，研究T

13、im-3對CD8+T細胞功能的影響。流式細胞術檢測結果顯示，與對照組相比，Tim-3-Fc處理組CD8+T細胞IFN-γ的表達明顯升高(p=0.0071)，且增殖明顯增加(p=0.0206)。4.Tim-3顯著促進慢乙肝患者外周CD8+T細胞的凋亡敏感性
　　 已有研究表明，Tim-3與其配體相互作用，介導CD4+T細胞凋亡。但Tim-3是否介導CD8+T細胞凋亡，迄今尚未見報道。
　　 4.1慢乙肝病人外周血CD8+T

14、細胞尤其是Tim-3陽性的CD8+T細胞凋亡明顯增加
　　 收集并分離健康志愿者及CHB病人PBMC，流式檢測Annexin(V)表達，分析CD8+T細胞凋亡率。結果表明，慢乙肝病人PBMC中CD8+T細胞的Annexin(V)表達較健康對照組顯著增加(p=0.0097)。進一步分析發(fā)現(xiàn)，CD8+T細胞中Tim-3陽性群Annexin(V)的表達明顯高于Tim-3陰性群(p=0.0002)。結果提示，慢乙肝病人外周血中上調表達的

15、Tim-3可能增加CD8+T細胞的凋亡敏感性。
　　 4.2CHB患者Tim-3陽性CD8+T細胞對AICD敏感性顯著高于Tim-3陰性群，且CD8+T細胞凋亡比例與Tim-3表達成正相關
　　 為了進一步研究Tim-3對CD8+T細胞凋亡的影響，本研究利用PMA、Ionmycin和抗CD3激動性抗體體外誘導PBMC的活化誘導凋亡(activationinducedapoptosis，AICD)，進而流式檢測CD8+T細

16、胞凋亡。結果顯示，與健康志愿者相比，CHB患者外周血CD8+T細胞的凋亡比例明顯增加(p＜0.0001)，并且Tim-3陽性的CD8+T細胞的凋亡比例顯著高于Tim-3陰性群(p=0.0018)，Tim-3表達與Annexin(V)的表達正相關(r=0.5965，p＜0.0001)。
　　 4.3封閉Tim-3途徑顯著降低CHB患者外周血CD8+T細胞的凋亡率
　　 Tim-3-Fc融合蛋白預處理CHB患者PBMC（Ig

17、G處理組為對照），封閉Tim-3途徑后，利用PMA、Ionmycin和抗CD3激動性抗體誘導AICD，結果顯示，封閉Tim-3明顯降低CHB患者外周血CD8+T細胞的凋亡率(p=0.0153)。
　　 綜上所述，慢乙肝患者外周血CD8+T表面Tim-3表達顯著升高，上調表達的Tim-3抑制CD8+T細胞HBV特異性增殖及分泌抗病毒細胞因子IFN-γ能力，并促進CD8+T細胞凋亡。提示，Tim-3是慢乙肝患者CD8+T細胞耗竭的重

18、要原因。
　　 第二部分Tim-3抑制CHB患者CD8+T細胞功能的機制研究
　　 已有文獻報道，Tim-3與其配體galectin-9相互作用抑制Th1細胞介導的免疫應答，誘導Th1免疫耐受。但Tim-3抑制CD8+T細胞的機制迄今尚未見報道。本研究在第一部分基礎上深入研究Tim-3抑制外周CD8+T細胞功能、介導CHB患者CD8+T耗竭的分子機制。
　　 1.Tim-3調節(jié)慢乙肝患者CD8+T細胞功能需要其他

19、免疫細胞參與
　　 本研究第一部分研究結果顯示，Tim-3可以調控CHB患者PBMC中CD8+T細胞功能。為進一步驗證Tim-3對CD8+T細胞的調節(jié)作用，本研究收集并純化CHB患者外周CD8+T細胞，進行阻斷實驗及共培養(yǎng)實驗。
　　 1.1阻斷實驗結果表明，Tim-3抑制CHB患者外周CD8+T細胞的HBs特異性IFN-γ分泌水平依賴于其它免疫細胞的存在
　　 分離CHB患者PBMC，磁珠分選純化單核細胞，IL

20、-4和GM-CSF刺激7天后誘導為未成熟DC，進而利用HBs抗原肽刺激24h誘導為成熟DC;同時磁珠分離純化同一個體外周血CD8+T細胞，Tim-3-Fc及對照IgG預處理40min后與上述成熟DC共培養(yǎng)(10∶1)，在HBs抗原肽刺激24h后，收集細胞，流式檢測CD8+T細胞的IFN-γ表達水平。結果顯示，與對照組相比，Tim-3-Fc處理組CD8+T細胞IFN-γ分泌水平?jīng)]有明顯差異(p=0.5552)。
　　 1.2阻斷實

21、驗結果表明，Tim-3抑制CHB患者外周CD8+T細胞的HBs特異性增殖能力依賴于其它免疫細胞的存在
　　 同上分離純化CHB患者外周血CD8+T細胞，CSFE染色后Tim-3-Fc及對照IgG預處理40min，再與HBs抗原肽刺激成熟的同體DC共培養(yǎng)(10∶1)，在HBs抗原肽刺激7天后流式檢測CD8+T細胞增殖。結果顯示，與對照組相比，Tim-3-Fc處理組CD8+T細胞的病毒特異性增殖能力沒有明顯差異(p=0.8857)。

22、
　　 1.3阻斷實驗結果表明，Tim-3促進CHB患者CD8+T細胞的凋亡敏感度依賴于其它免疫細胞的存在
　　 同上分離純化慢乙肝病人外周血CD8+T細胞，Tim-3-Fc融合蛋白預處理，封閉Tim-3通路（同型對照IgG處理組作為對照），PMA、Ionmycin和抗CD3激動性抗體體外誘導CD8+T細胞的活化誘導凋亡，流式分析結果顯示，封閉Tim-3通路，不能影響純化CD8+T細胞對AICD的敏感性(p=0.4033

23、)。
　　 上述結果提示，Tim-3對CHB患者外周CD8+T的功能負調控依賴于其他免疫細胞的存在。
　　 2.NK細胞參與Tim-3對慢乙肝患者CD8+T細胞的功能抑制作用
　　 NK細胞是機體抗病毒免疫的重要固有免疫細胞。文獻報道在抗病毒感染過程中NK細胞不僅直接殺傷病毒感染細胞，而且對適應性免疫應答具有調節(jié)作用。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，HBV慢性感染者NK細胞Tim-3表達顯著升高，并抑制NK功能。本研究利用

24、磁珠分選的方法，剔除慢乙肝患者PBMC中的NK細胞后以Tim-3-Fc融合蛋白預處理，封閉Tim-3途徑，再以HBs抗原肽刺激，流式細胞術檢測CD8+T細胞的IFN-γ表達及增殖情況。結果顯示，與對照組相比，封閉Tim-3后，剔除NK細胞PBMC中CD8+T細胞IFN-γ的表達(p=0.9160)及增殖(p=0.5102)均沒有明顯變化。提示，NK細胞參與Tim-3介導的對慢乙肝患者CD8+T細胞的抑制作用。
　　 3.NK細胞

25、參與Tim-3介導的慢乙肝CD8+T功能抑制的分子機制
　　 眾多文獻已經(jīng)證實，NK細胞不僅是重要的固有免疫細胞，而且具有重要的免疫調節(jié)作用。NK細胞既可以通過直接接觸抑制適應性免疫細胞，又可以通過分泌細胞因子調控適應性免疫細胞。前述研究結果強烈提示，NK細胞是Tim-3抑制慢乙肝CD8+T細胞所必需的。為研究其分子機制，我們設計從兩方面進行研究:1）NK是否表達Tim-3配體galectin-9，并通過Tim-3/galect

26、in-9相互作用抑制CD8+T細胞功能？2）本研究室前期已經(jīng)證明，Tim-3可以抑制NK細胞功能，尤其是抑制NK分泌IFN-γ;而IFN-γ具有重要的免疫調節(jié)作用，可以促進CD8+T細胞應答。那么，Tim-3是否通過抑制NK細胞因子分泌IFN-γ，進而抑制慢乙肝CD8+T細胞功能？為解決上述問題，我們進行了系列研究并取得如下結果:
　　 3.1NK表達的galectin-9參與Tim-3介導的對慢乙肝CD8+T功能抑制作用

27、>　　 3.1.1CHB患者外周血NK細胞高表達Tim-3配體galectin-9
　　 Galectin-9是目前已知的Tim-3的配體，已有研究表明galectin-9在單核細胞表達，但是galectin-9在其它免疫細胞的表達尚不明確。為了檢測galectin-9在PBMC各細胞亞群中的表達，本研究收集CHB患者PBMC，并用磁珠分選的方法純化CD8+T細胞及NK細胞。RT-PCR檢測galectin-9的表達。結果顯示

28、，galectin-9在PBMC，CD8+T和NK細胞均有表達，且NK細胞表達較強。提示，NK細胞可能為CD8+T細胞提供配體與Tim-3相互作用，并調節(jié)CD8+T細胞功能。
　　 3.1.2抑制NK細胞表面galectin-9，明顯促進CHB患者CD8+T細胞IFN-γ表達及其增殖能力。
　　 為了研究NK細胞表達的galectin-9在Tim-3介導的對CHB患者CD8+T細胞抑制中的作用，我們進行了如下實驗:分離慢

29、乙肝PBMC，磁珠分選純化NK細胞，與galectin-9抑制劑lactose共孵育40min（sucrose作為對照），阻斷NK細胞galectin-9通路。收集上述剔除NK細胞的PBMC與Tim-3-Fc共孵育40min后，與lactose預處理的NK細胞共培養(yǎng)，HBs抗原肽刺激6小時后，流式細胞術檢測CD8+T細胞的IFN-γ的表達。結果顯示，lactose處理組CD8+T細胞表達IFN-γ(p=0.0033)能力明顯高于sucr

30、ose處理對照組。提示，阻斷NK上的Tim-3配體能顯著促進PBMC中CD8+T細胞IFN-γ分泌水平。
　　 同上收集去除NK后的慢乙肝PBMC，CFSE染色后經(jīng)Tim-3-Fc預處理，再與lactose預處理的同體NK細胞共培養(yǎng)，HBs抗原肽刺激5天后，流式細胞術檢測CD8+T細胞的增殖。結果顯示，lactose處理組CD8+T細胞的增殖(p=0.0464)能力明顯高于sucrose處理對照組，提示，阻斷NK上的Tim-3配

31、體能顯著促進PBMC中CD8+T細胞增殖能力。
　　 綜上，Tim-3抑制慢乙肝患者外周血CD8+T細胞功能依賴于NK細胞的存在，NK表達的galectin-9參與其中。
　　 3.2.Tim-3通過抑制NK細胞分泌IFN-γ抑制CD8+T細胞的功能
　　 有文獻報道，腫瘤病人體內(nèi)NK細胞可以抑制CD8+T細胞功能。為確實慢性HBV感染過程中NK細胞是否抑制CD8+T細胞功能，本研究首先進行了NK細胞剔除實驗。<

32、br>　　 3.2.1去除NK細胞后CHB患者CD8+T細胞增殖及分泌IFN-γ能力明顯增強
　　 收集慢乙肝病人外周血，分離PBMC，磁珠純化分離NK細胞，收集剔除NK的PBMC（PBMC作為對照），種板后，HBs抗原肽刺激，流式分析CD8+T細胞的IFN-γ表達水平。結果顯示，去除NK細胞后，CHB患者PBMC中CD8+T細胞的IFN-γ表達水平(p=0.0284)明顯增強。
　　 同上收集去除NK的慢乙肝病人PB

33、MC，CFSE染色后，種板，HBs抗原肽刺激，流式分析CD8+T細胞的增殖能力。結果顯示，去除NK細胞后，CHB患者PBMC中CD8+T細胞的增殖能力明顯增強(p=0.002)。
　　 上述結果提示，同腫瘤環(huán)境一樣，慢乙肝感染過程中NK細胞抑制病毒特異性CD8+T細胞的功能。
　　 3.2.2封閉NK細胞表面的Tim-3信號途徑后，CD8+T細胞的功能明顯增強
　　 本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，慢乙肝患者NK細胞Tim

34、-3表達升高，進而抑制NK細胞功能。但Tim-3分子是否參與NK細胞對HBV特異性CD8+T細胞的負向調節(jié)作用還未見報道。
　　 本研究利用磁珠分選的方法從慢乙肝病人PBMC中純化NK細胞，anti-humanTim-3抗體預處理封閉Tim-3信號途徑（IgG做對照）后與剔除NK細胞的同體PBMC共培養(yǎng)，HBs抗原肽刺激后，流式細胞術結果顯示，封閉NK細胞表面的Tim-3信號途徑可明顯上調CHB患者PBMC中HBV特異性CD8+

35、T細胞的IFN-γ表達水平(p=0.0042)及其增殖能力(p=0.0218)。
　　 3.2.3封閉CD8+T細胞表面的IFN-γ受體后，NK細胞對HBV特異性CD8+T細胞的抑制作用消失
　　 已有研究結果顯示，NK細胞在LCMV感染過程中通過分泌IFN-γ調控CD8+T細胞應答。本課題組前期研究結果表明，慢乙肝病人外周血NK細胞表達Tim-3明顯升高，并抑制NK細胞分泌IFN-γ水平，那么NK細胞是否通過該途徑進而

36、抑制HBV特異性CD8+T細胞的功能尚不明確。
　　 本研究收集去除NK細胞的慢乙肝PBMC，平均分成兩部分，一部分與IFN-γ受體的阻斷性抗體共孵育40min以封閉IFN-γ途徑，另一部分與同型對照IgG抗體共孵育作對照）;上述兩組細胞分別與anti-humanTim-3抗體預處理的同體NK細胞共培養(yǎng)，HBs抗原肽刺激，流式細胞術檢測IFN-γ表達。結果顯示，與對照組相比，IFN-γ受體封閉組CD8+T細胞病毒特異性IFN-γ

37、表達水平(p=0.0466)明顯下調。上述共培養(yǎng)體系經(jīng)CFSE染色后流式細胞術檢測CD8+T細胞的增殖，結果顯示，IFN-γ受體封閉組CD8+T細胞病毒特異性增殖能力明顯下降(p=0.0020)。提示，Tim-3介導的NK細胞IFN-γ分泌減少是NK細胞抑制HBV特異性CD8+T細胞功能的機制之一。
　　 綜上，慢性乙肝感染過程中，上調表達的Tim-3分子抑制NK細胞分泌調節(jié)性細胞因子IFN-γ，從而抑制病毒特異的CD8+T細胞