HMGB1調(diào)控MDSCs分化參與乳腺癌發(fā)生的機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　1.通過對(duì)乳腺癌中HMGB1表達(dá)量、MDSCs比例的檢測(cè)，分析兩者在乳腺癌中的關(guān)系。
　　2.通過檢測(cè)HMGB1、MDSCs之間的關(guān)系，研究HMGB1對(duì)MDSCs分化的影響及其潛在的分子機(jī)制。
　　方法：
　　1.分別從正常鼠、荷瘤鼠中分離出外周血、脾臟和腫瘤，流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血、脾臟中MDSCs的比例，qRT-PCR和Western blotting法測(cè)定荷瘤鼠腫瘤中HMGB1、iNOS及ARG1

2、的表達(dá)水平。
　　2.分離正常小鼠的骨髓、脾臟，分為對(duì)照組、HMGB1組、GM-CSF+IL-6組、GM-CSF+IL-6+HMGB1組和GM-CSF+IL-6+HMGB1+ethyl pyruvate(EP)組進(jìn)行體外刺激48h后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)MDSCs、DCs和巨噬細(xì)胞的比例。
　　3. Western blot法檢測(cè)0min、15min、30 min、60 min、90 min和120 min六個(gè)時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞中ERK1

3、/2、STAT3、NF-κB和P38 MAPK蛋白磷酸化水平的改變，骨髓細(xì)胞用PDTC、Niclosamide、SB203580、U0126預(yù)處理1h后，再加入HMGB1重組蛋白刺激，流式細(xì)胞儀檢測(cè)MDSCs的比例。
　　4.乳腺癌荷瘤鼠建模成功后，隨機(jī)分為兩組，一組給予EP治療，另一組給予PBS治療，3天一次，分別于25d和40d處死荷瘤鼠，流式細(xì)胞儀檢測(cè)脾臟、腫瘤中MDSCs的比例。
　　5.從健康的BALB/c小鼠股骨

4、中取出骨髓，用MDSCs免疫磁珠體外分選出G-MDSCs和M-MDSCs，體外用重組HMGB1刺激48h后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞中MDSCs、DCs和巨噬細(xì)胞的比例。
　　結(jié)果：
　　1.流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示荷瘤鼠外周血、脾臟中MDSCs的比例顯著高于正常鼠,
　　qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中HMGB1、iNOS和ARG1的表達(dá)量都顯著高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.經(jīng)過48h刺激后，流式細(xì)胞儀

5、檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn) HMGB1組、GM-CSF+IL-6組、GM-CSF+IL-6+HMGB1組相比于對(duì)照組，MDSCs比例增加，DCs和巨噬細(xì)胞的比例減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；GM-CSF+IL-6+HMGB1+EP組相比于 GM-CSF+IL-6+HMGB1組，MDSCs比例減少，DCs和巨噬細(xì)胞的比例增加。
　　3.細(xì)胞給予250ng/mL HMGB1刺激后，0至120min內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)p-ERK1/2、p-NF-κB、p-P38水平

6、隨著時(shí)間推移逐漸增高，而 p-STAT3卻沒有這種趨勢(shì)；給予 U0126、SB203580和PDTC作用后，MDSCs比例下降且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而Niclosamide作用后MDSCs比例雖下調(diào)但并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4.荷瘤鼠給予 EP治療后，EP組相比于 PBS組，腫瘤的體積、重量、脾臟和腫瘤中MDSCs比例均減少且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　5. MDSCs免疫磁珠體外分選出G-MDSCs和M-MDSCs，體外用HMGB1重