家蠶絲腺高豐度表達基因Bmtdh和Bmsps1的克隆和功能分析.pdf

1、家蠶絲腺是昆蟲中蛋白質(zhì)合成能力最強的生物器官，能在相當短的時間內(nèi)高效表達合成蠶絲蛋白，是研究基因時空特異性表達調(diào)控機制的理想材料。蠶絲蛋白由絲素和絲膠2部分組成，其表達合成過程有眾多基因和相關(guān)調(diào)節(jié)因子的參與。直接編碼絲素蛋白的基因有fib-L、fib-H和P25共3個，已被深入研究。已經(jīng)分離克隆的編碼絲膠蛋白的基因有Serl、Ser2、S3、S4和S5共5個。其他一些與蠶絲蛋白合成相關(guān)的基因和調(diào)節(jié)因子主要有：SGF-B、BmFA、Ub2

2、a和Ub2b復合體、TRIO復合體和PSGF調(diào)節(jié)蛋白等絲腺特異轉(zhuǎn)錄因子，tRNAAla、tRNALys、tRNAGlu、tRNAPhe和tRNAGly等tRNA基因及其轉(zhuǎn)錄因子TFIIIR，真核翻譯延長因子Ⅰ和其他一些特異調(diào)節(jié)因子。這些基因和相關(guān)因子的發(fā)現(xiàn)為闡明蠶絲蛋白的表達調(diào)控機制作了很好的嘗試，但由于這一機制的復雜性，仍有許多未明之處有待繼續(xù)深入研究。 為進一步闡明蠶絲蛋白的表達調(diào)控機制，在家蠶基因組和大量EST數(shù)據(jù)分析的基

3、礎(chǔ)上，本論文選擇了可能參與蠶絲蛋白合成過程的2個基因Bmtdh和Bmspsl，對它們進行了克隆和序列分析，用RT-PCR試驗分析了它們的時空表達特性，并在大腸桿菌中嘗試了Bmspsl基因的誘導表達，獲得結(jié)果如下： 1.Bmtdh基因的序列和結(jié)構(gòu)Bmtdh基因編碼家蠶的蘇氨酸脫氫酶(TDH酶)，克隆的該基因cDNA長1310bp(登錄號：ABA43639.1)，包括227bp5’-UTR序列，在基因組中單拷貝存在。其外顯子有3個，

4、其中Extron1長333bp，位于Scaffold006584上；Extron2和Extron3長度分別為791bp和186bp，均位于Scaffold003119上。第2內(nèi)含子長1365bp，位于Scaffold003119上；第1內(nèi)含子因跨2個Scaffold而不能確定。其ORF長1026bp，編碼342個氨基酸，預測其蛋白質(zhì)的分子量為39.1kDa，含有4個Cys，可形成2個二硫鍵，等電點為8.69。 2.Bmtdh基因

5、的保守功能域和系統(tǒng)進化分析Bmtdh基因的推導氨基酸序列含有一個完整的表面異構(gòu)酶功能域(Ile29-Val322.)，具有NAD+結(jié)合特性，說明Bmtdh基因的編碼蛋白具有表面異構(gòu)酶活性。比較家蠶與其他物種TDH酶的同源性表明，其與果蠅、按蚊和蜜蜂的相似性分別為90﹪、91﹪和88﹪，與家豬和小鼠的相似分別為77﹪和75﹪，而與大腸桿菌的相似性僅為41﹪。利用包括家蠶在內(nèi)的33個物種的TDH酶氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹，能很好地反映這些

6、物種在進化上的親緣關(guān)系。 3.Bmtdh基因的RT-PCR分析對5齡3天6個組織的RT-PCR試驗發(fā)現(xiàn)，Bmtdh基因在家蠶的絲腺和卵巢中的轉(zhuǎn)錄水平都很高，在中腸、血液、脂肪體、馬氏管4個組織中的轉(zhuǎn)錄水平較低，這與EST數(shù)據(jù)的分析結(jié)果基本相同。11個不同發(fā)育時期的RT-PCR試驗表明，Bmtdh基因在4齡眠期、5齡1天和5齡3天三個發(fā)育時期的絲腺中轉(zhuǎn)錄水平都很高，而在此前的8個發(fā)育時期的轉(zhuǎn)錄水平都比較低，其中再卵期(G2胚胎)和

7、1齡2天兩個發(fā)育時期沒有轉(zhuǎn)錄。 4.Bmspsl基因的序列和結(jié)構(gòu)Bmspsl基因編碼家蠶的硒磷酸合成酶Ⅰ(SPSl)，克隆的cDNA長1817bp(登錄號：ABA43640.1)，包括256bp5'-UTR序列和1209bp的完整ORF，其3’-UTR序列由家蠶同源EST拼接得到。應(yīng)用BLASTN程序檢索家蠶基因組數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)Bmspsl基因只有一個拷貝，位于Scaffold005966上，且沒有內(nèi)含子。用克隆ORF序列的引物，

8、以家蠶基因組DNA作模板進行PCR試驗，結(jié)果也進一步證實Bmspsl基因沒有內(nèi)含子存在。 5.Bmspsl基因的保守功能域和系統(tǒng)進化分析家蠶Bmspsl基因的推導氨基酸序列包含2個功能域：SelDN(Leu45-Pro208，E=4e-49)和AIRS_C(Gly220-Asp391，E=8e-10)。SelD_N是硒磷酸合成酶N末端結(jié)構(gòu)域，具有典型的ATP結(jié)合特性；AIRS_C是AIR合酶相關(guān)蛋白C末端結(jié)構(gòu)域。因此家蠶Bmsp

9、sl基因的編碼蛋白屬于AIR合酶家族，具有硒磷酸合成酶的結(jié)構(gòu)特征。比較家蠶與其他物種SPSl蛋白之間的同源性顯示，其與果蠅、人和線蟲的相似性分別為94﹪、86﹪和66﹪，而與大腸桿菌的相似性僅為42﹪。用包括家蠶在內(nèi)的32個物種的SPSI蛋白的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹發(fā)現(xiàn)，32個物種在總體上分成3大類群：細菌，古細菌和真核生物。在真核生物中，昆蟲和脊椎動物分別獨立聚類成為2個亞群，而原生動物沒能聚類在一起。 6.Bmspsl基因

10、的RT-PCR分析對5齡3天6個組織的RT-PCR試驗發(fā)現(xiàn)，Bmspsl基因在家蠶絲腺中的轉(zhuǎn)錄水平很高，在中腸、血液、脂肪體、馬氏管、卵巢5個組織中的轉(zhuǎn)錄水平較低，這與EST數(shù)據(jù)的分析結(jié)果也完全吻合。11個不同發(fā)育時期的RT-PCR試驗發(fā)現(xiàn)，Bmspsl基因在發(fā)育后期(4齡眠期、5齡l天和5齡3天)的絲腺中一直維持較高的轉(zhuǎn)錄水平，在卵期、1齡眠期和2齡2天時期的轉(zhuǎn)錄水平也比較高，其他5個發(fā)育時期卻很低。 7.Bmspsl基因的原