低氧誘導因子-1α在良性氣管狹窄患者瘢痕形成中的作用及機制研究.pdf

1、良性氣道狹窄是指氣管支氣管結(jié)核、外傷、手術(shù)、氣管切開、氣管插管、異物、良性腫瘤、淀粉樣變等引起的氣道占位性或瘢痕攣縮性狹窄，以及復(fù)發(fā)性多軟骨炎和甲狀腺囊腫對氣道壁的破壞引起的氣道塌陷性狹窄。近年來隨著搶救和呼吸支持等搶救技術(shù)水平的提高，以及肺移植、氣道手術(shù)的開展和普及，氣道狹窄的發(fā)生率逐漸增高，而由復(fù)發(fā)性多軟骨炎和甲狀腺囊腫對氣道壁的破壞引起的氣道塌陷性狹窄較少見。其中引起氣管瘢痕性狹窄的常見原因之一是氣道創(chuàng)傷。氣道狹窄已成為呼吸系統(tǒng)的

2、一種常見疾病，其中良性氣道狹窄也成為呼吸介入領(lǐng)域的常見疾病。
　　低氧誘導因子1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）是組織在缺氧環(huán)境下介導適應(yīng)性反應(yīng)的關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子，是哺乳動物和人體細胞內(nèi)存在的一類氧依賴性保護性核轉(zhuǎn)錄因子，在低氧條件下可與靶基因的缺氧應(yīng)答原件結(jié)合，從而激活靶基因的轉(zhuǎn)錄。HIF-1由α、β兩個亞基組成，其活性主要由α亞基決定。HIF-1α既是HIF-1的調(diào)節(jié)亞基又是活性亞基，其蛋白穩(wěn)

3、定性和轉(zhuǎn)錄活性均受細胞內(nèi)氧濃度的調(diào)節(jié)。受HIF-1調(diào)控的基因包括血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelialgrowth factor，VEGF)、轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor，TGF-β)、組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑1(tissue inhibitor ofmetalloproteinase-1，TIMP-1)、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinases，MMP

4、)、堿性成纖維細胞生長因子(Basic fibroblastgrowth factors，bFGF)等。這些靶基因與血管新生、糖代謝、細胞生存及凋亡等有關(guān)。國內(nèi)外最初關(guān)于HIF-1α的大量研究集中在其對實體腫瘤的增長及轉(zhuǎn)移作用方面，認為HIF-1α信號通路在維持腫瘤干細胞特征和轉(zhuǎn)移發(fā)生中起舉足輕重的作用，可促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。同時有研究表明HIF-1α抑制劑可能成為非常有前景的抗實體腫瘤靶向治療藥物。
　　近年來，瘢痕疙瘩中的低

5、氧環(huán)境及HIF-1α在瘢痕形成及收縮過程中的作用受到越來越廣泛的關(guān)注。氣道狹窄瘢痕本質(zhì)上是纖維增殖性疾病，以膠原為主的細胞外基質(zhì)過度表達和成分改變是氣道狹窄瘢痕的病理特征。鄭旭東等報道，瘢痕疙瘩中成纖維細胞在缺氧狀態(tài)下HIF-1α蛋白表達上調(diào)，HIF-1α調(diào)控的缺氧通路可以提高成纖維細胞活性并參與瘢痕形成。Daniele M等進行的體外研究發(fā)現(xiàn)，低氧環(huán)境下HIF-1α可以促進成纖維細胞分泌細胞外基質(zhì)，膠原合成增加。Zhang等的研究也證

6、實了上述發(fā)現(xiàn)并且提出瘢痕疙瘩中HIF-1α表達的增加與ERK1/2和Akt通路激活有關(guān)。Vincent等研究發(fā)現(xiàn)人類皮膚瘢痕疙瘩中成纖維細胞的生物學特性與腫瘤細胞相似，并且認為瘢痕疙瘩對放療的不敏感與病變組織內(nèi)HIF-1α的高表達有密切關(guān)系。Robert M等研究表明心肌纖維細胞在低氧環(huán)境下可以向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化。此外，HIF-1α也可以通過增加細胞外基質(zhì)的合成，減少細胞外基質(zhì)降解，參與腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生。而HIF-1α是否參與良性氣道

7、狹窄疾病的瘢痕組織形成及其相關(guān)信號轉(zhuǎn)導通路目前尚無報道。
　　本研究旨在探討HIF-1α在良性氣道狹窄患者瘢痕形成中的作用及機制。前兩部分研究在組織學水平探討HIF-1α及其下游靶基因在良性氣道狹窄患者瘢痕中的表達，以及瘢痕形成過程中成纖維細胞的活化。后兩部分通過對成纖維細胞的鑒定以及在體外低氧培養(yǎng)建立成纖維細胞缺氧模型，在細胞水平進一步驗證HIF-1α對成纖維細胞的活化作用及其下游信號分子參與瘢痕形成的機制。論文主要從以下幾部分

8、展開論述:
　　第一部分 低氧誘導因子HIF-1α在良性氣道狹窄患者瘢痕中的表達
　　目的:探討低氧誘導因子-1α在良性氣道狹窄患者瘢痕中的表達。
　　方法:根據(jù)電子支氣管鏡下檢查結(jié)果，將患者分為三組（8人/組），即肉芽腫組（granulation phase group，GRA）、增生組(proliferativephase group，PRO)、瘢痕組(mature phase group，MAT)。采用Real-

9、timePCR和westernblot方法檢測三組良性氣道狹窄患者肉芽組織HIF-1α的表達量。
　　結(jié)果:HIF-1αmRNA水平在肉芽期最高，與增殖期、瘢痕期相比有統(tǒng)計學差異(p＜0.01)，增殖期HIF-1αmRNA水平高于瘢痕期，且亦有統(tǒng)計學差異(p＜0.01)。
　　三組間HIF-1α蛋白表達量也不同，肉芽期HIF-1α蛋白表達最多(p＜0.05)，然后逐漸下降，瘢痕期蛋白表達最低，與其它兩組相比p＜0.01，差異

10、有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)論:氣道狹窄瘢痕形成初期即肉芽腫期HIF-1α表達最多，之后呈逐漸下降趨勢，在成熟期HIF-1α的表達最低，提示HIF-1α與氣道狹窄形成有關(guān)。
　　第二部分 低氧誘導因子HIF-1α介導氣道狹窄患者瘢痕組織形成的機制研究
　　目的:探討低氧誘導因子-1α介導良性氣道狹窄患者瘢痕組織形成的機制。
　　方法:根據(jù)電子支氣管鏡下檢查結(jié)果，將患者分為三組（8人/組），即肉芽腫組、增生組、瘢痕組。用

11、western blot方法檢測良性氣道狹窄患者氣道病變組織的α-SMA、Caspase3、Ⅰ型/Ⅲ型膠原、VEGF、bFGF、TGF-β蛋白的表達。
　　結(jié)果:1與肉芽腫期及成熟期比較，α-SMA的表達量在增殖期最高(p＜0.05)，成熟期表達最低，且成熟期與肉芽腫期相比明顯下降(p＜0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。2不同階段Ⅰ型、Ⅲ型膠原以及TGF-β的蛋白表達與α-SMA呈相同的變化趨勢，且Ⅰ型與Ⅲ型膠原的比值呈現(xiàn)相同的趨勢。

12、3 VEGF蛋白表達呈逐漸下降趨勢，肉芽腫期表達最多，明顯高于增殖期及成熟期(p＜0.05)，成熟期表達最少，與增殖期相比明顯下降(p＜0.05)，差異均有統(tǒng)計學意義。4不同階段bFGF與Caspase-3的蛋白表達與VEGF呈相同的變化趨勢。
　　結(jié)論:1.Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白量及二者比值在肉芽期及增殖期明顯增加，成熟期下降，提示肌成纖維細胞的增殖及分泌功能活躍在氣道狹窄形成中有重要作用。2.VEGF蛋白表達在肉芽腫期及增殖期均明

13、顯增加，肉芽腫期最多，然后逐漸下降，成熟期最低，提示VEGF在氣管創(chuàng)傷愈合及瘢痕形成中發(fā)揮重要作用。3.肉芽腫期bFGF表達最多，成熟期明顯下降，提示bFGF參與了良性氣道狹窄的形成，這與其刺激血管形成有密切關(guān)系。4.Caspase-3在瘢痕期的表達明顯低于肉芽腫期及增殖期，提示氣管瘢痕形成不同時期成纖維細胞凋亡逐漸受抑制，而增殖性大大增加，故在臨床上表現(xiàn)為浸潤性生長，及易復(fù)發(fā)性。
　　第三部分 良性氣道狹窄患者瘢痕組織中成纖維細

14、胞分離和鑒定
　　目的:體外進行良性氣道狹窄患者瘢痕組織中成纖維細胞的分離、純化和鑒定，以進行細胞水平的研究。
　　方法:用組織塊培養(yǎng)方法對良性氣道狹窄患者的瘢痕組織進行原代培養(yǎng)，分離成纖維細胞，在倒置顯微鏡下進行形態(tài)觀察，用HE染色及免疫組化方法進行鑒定。
　　結(jié)果:1.倒置顯微鏡下觀察貼壁細胞為典型的長梭形，其胞體較大，細胞界限清楚，立體感強，折光性高。2.免疫組化結(jié)果顯示細胞波形蛋白染色呈陽性，胞漿內(nèi)見大量棕黃色

15、顆粒。3.HE染色顯示細胞呈長梭形，輪廓清楚，核仁大而明顯。
　　結(jié)論:用改良組織塊培養(yǎng)方法培養(yǎng)出的細胞經(jīng)形態(tài)觀察及免疫組織化學和HE染色，鑒定為成纖維細胞。
　　第四部分 低氧環(huán)境下HIF-1α對成纖維細胞活化及凋亡的調(diào)控及其機制研究
　　目的:探討HIF-1α對成纖維細胞活化和凋亡的調(diào)控及其機制。
　　方法:1.體外分離培養(yǎng)氣道狹窄局部成纖維細胞，采用三氣培養(yǎng)體系建立低氧-成纖維細胞體外細胞培養(yǎng)模型。選用第3

16、～4代氣道肉芽組織成纖維細胞隨機分為四組，將其置于4％低氧濃度的培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng)12h、24 h、48 h及72 h，用Real-time PCR和western blot方法檢測HIF-1α、α-SMA、bFGF、VEGF及TGF-β mRNA和蛋白的表達。2.選用第3～4代肉芽組織成纖維細胞隨機分為四組，分別置于含4％、8％、16％低氧及正常氧濃度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12h，用Real-timePCR和western blot方法檢測HI

17、F-1α、α-SMA、bFGF、VEGF及TGF-βmRNA和蛋白的表達。
　　結(jié)果:1.4％低氧濃度培養(yǎng)條件下，隨著時間的延長，HIF-1αmRNA及蛋白表達水平逐漸升高(p＜0.05)，其靶基因α-SMA、VEGF、bFGF及TGF-β的mRNA及蛋白表達水平在低氧環(huán)境下培養(yǎng)不同時間后，相對于對照組而言，均有不同程度的增高。2.在16％，8％，4％不同低氧濃度下培養(yǎng)相同時間，HIF-1αmRNA及蛋白表達水平隨著氧濃度的逐漸降

18、低而升高(p＜0.05)。其靶基因α-SMA、VEGF、bFGF及TGF-β的mRNA及蛋白表達水平在不同低氧濃度下相對于正常氧濃度組而言，均有不同程度的增高。
　　結(jié)論:低氧環(huán)境刺激成纖維細胞不同時間或逐漸降低氧濃度但培養(yǎng)相同時間均可以促進HIF-1α及其靶基因α-SMA、bFGF、VEGF及TGF-β mRNA和蛋白的表達。提示HIF-1α可以通過活化成纖維細胞，促進與新血管生成及細胞增殖有關(guān)基因的表達來參與良性氣道狹窄患者瘢