HDAC參與瘢痕疙瘩形成的作用及機(jī)制研究.pdf

1、瘢痕疙瘩是皮膚創(chuàng)傷后引發(fā)的以成纖維細(xì)胞異常增殖并分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)為主要特征的一種皮膚纖維化疾病,治療效果不佳,復(fù)發(fā)率較高,發(fā)病機(jī)制尚不清楚。近年來研究發(fā)現(xiàn),組蛋白去乙?；?histone deacetylase,HDAC)活性增高與多種組織和器官纖維化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),使用HDAC抑制劑降低HDAC活性可抑制皮膚正常成纖維細(xì)胞ECM的合成。同時(shí)HDAC活性增高還是多種腫瘤發(fā)生的病

2、理機(jī)制,使用HDAC抑制劑可以通過激活凋亡信號,使異常增殖的腫瘤細(xì)胞生長停滯,誘導(dǎo)其凋亡。所以我們也推測HDAC活性增加可能與瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖和分泌大量 ECM密切相關(guān)。本課題將研究 I型HDAC(HDAC1和HDAC2)在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中的表達(dá)情況,并使用 HDAC抑制劑TSA進(jìn)行體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行干預(yù),以期闡明I型HDAC是如何參與瘢痕疙瘩形成的病理機(jī)制,為HDAC抑制劑類藥物臨床應(yīng)用預(yù)防和治療瘢痕疙瘩提供理論基礎(chǔ)。

3、r>　　實(shí)驗(yàn)一 HDAC1和HDAC2在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:本實(shí)驗(yàn)旨在研究I型HDAC(HDAC1和HDAC2)在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中的表達(dá)情況,并與正常皮膚成纖維細(xì)胞相比較,以期為瘢痕疙瘩提供新的發(fā)病機(jī)制,及治療的新切入點(diǎn)。
　　方法:我們首先進(jìn)行瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞與正常皮膚成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)。接著通過RT-PCR和western blot方法檢測HDAC1和HDAC2在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中的表達(dá)

4、情況,并與正常皮膚成纖維細(xì)胞相比較。
　　結(jié)果:我們通過 RT-PCR方法檢測發(fā)現(xiàn),瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞 HDAC1和 HDAC2 mRNA的表達(dá)均比正常皮膚成纖維細(xì)胞明顯增高。接著,用western blot方法檢測同樣證實(shí)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞HDAC1和HDAC2蛋白的表達(dá)也均比正常皮膚成纖維細(xì)胞要高。
　　結(jié)論:我們的研究證實(shí)HDAC1和HDAC2在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中的表達(dá)明顯增高。HDAC1和HDAC2的活性增強(qiáng),可以

5、使原有的基因表達(dá)平衡狀態(tài)被打破,從而導(dǎo)致細(xì)胞增殖、凋亡和纖維化等生物學(xué)特征的異常,這可能是瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞過度增殖并合成大量ECM的病理新機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)二 HDAC抑制劑TSA誘導(dǎo)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:HDAC抑制劑TSA可以引起多種惡性增殖的細(xì)胞生長停滯,促進(jìn)其發(fā)生凋亡,本實(shí)驗(yàn)旨在研究 TSA是否可以誘導(dǎo)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞發(fā)生凋亡及 TSA對細(xì)胞HDAC1和HDAC2蛋白表達(dá)的影響。
　　方

6、法:首先,我們向培養(yǎng)的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞加入不同濃度的HDAC抑制劑TSA(200 nmol/L、400 nmol/L、600 nmol/L和800 nmol/L),運(yùn)用MTT法檢測TSA對細(xì)胞活力的影響。然后,通過Hoechst染色和流式細(xì)胞儀檢測TSA誘導(dǎo)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞發(fā)生凋亡的作用。最后,運(yùn)用western blot方法檢測TSA對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞HDAC1和HDAC2蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:通過MTT法檢測TSA

7、對細(xì)胞增殖的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著濃度和時(shí)間的變化, TSA抑制細(xì)胞的增殖存在量效性和時(shí)效性的特點(diǎn)。成纖維細(xì)胞對于200 nmol/L TSA作用耐受性良好,在600 nmol/L和800 nmol/L TSA作用下,細(xì)胞活力明顯下降。隨后600 nmol/L TSA單獨(dú)作用瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞,通過Hoechst染色和流式細(xì)胞儀檢測同樣證實(shí)TSA可以誘導(dǎo)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞發(fā)生凋亡。最后,運(yùn)用western blot方法檢測發(fā)現(xiàn)600 nmo

8、l/L TSA處理瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞48 h后,瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞HDAC1和HDAC2蛋白的表達(dá)明顯受到了抑制。
　　結(jié)論:我們的研究證實(shí)HDAC抑制劑TSA可以抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡,這可能是通過抑制HDAC1和HDAC2的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。
　　實(shí)驗(yàn)三 HDAC抑制劑TSA抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞膠原合成的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:本實(shí)驗(yàn)旨在研究HDAC抑制劑TSA是否可以抑制TGF-β促瘢痕疙瘩成纖維細(xì)

9、胞膠原合成的作用。
　　方法:我們分別通過RT-PCR和western blot方法檢測600 nmol/L TSA單獨(dú)作用或者聯(lián)合5 ng/ml TGF-β1蛋白對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞I型膠原(collagen I)mRNA和蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:通過RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn),向培養(yǎng)的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞加入5 ng/ml TGF-β1,可以促進(jìn)細(xì)胞 collagen I mRNA合成,而同時(shí)加入600 nmol/L TSA

10、后,可以抑制TGF-β1促進(jìn)細(xì)胞collagen I mRNA合成的作用。單獨(dú)使用600 nmol/L TSA后這種抑制作用會(huì)更加顯著。Western blot方法檢測同樣證實(shí)TSA可以抑制細(xì)胞collagen I蛋白的合成。
　　結(jié)論:我們的研究證實(shí)HDAC抑制劑TSA可以抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞膠原合成,這就為這種已經(jīng)在臨床治療多種腫瘤的HDAC抑制劑應(yīng)用于瘢痕疙瘩臨床預(yù)防和治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　實(shí)驗(yàn)四 HDAC抑制劑T

11、SA抑制兔耳增生性瘢痕形成的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:已證實(shí)HDAC抑制劑TSA能夠有效抑制體外培養(yǎng)的皮膚成纖維細(xì)胞膠原合成而起到抗纖維化作用,本部分實(shí)驗(yàn)擬通過兔耳增生性瘢痕模型驗(yàn)證TSA是否能夠在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)抑制瘢痕的形成。
　　方法:建立兔耳增生性瘢痕模型。每個(gè)兔耳做4個(gè)直徑為1 cm,間距為2 cm的圓形全層皮膚缺損創(chuàng)面。每只兔的左耳為TSA治療組,分別在創(chuàng)面上皮化后創(chuàng)面局部注射TSA,每個(gè)創(chuàng)面使用0.02％TSA0.05 ml

12、。連續(xù)注射1周。右耳為對照組,分別在相同時(shí)間點(diǎn)局部注射相同劑量生理鹽水0.05 ml。術(shù)后第23 d收集瘢痕標(biāo)本,進(jìn)行RT-PCR和western blot檢測collagen I和纖維連接蛋白(fibronectin)mRNA和蛋白的表達(dá)情況。術(shù)后第45 d收集瘢痕標(biāo)本,行 HE染色切片計(jì)算瘢痕增生指數(shù)(scar elevation index,SEI)。
　　結(jié)果:TSA治療組瘢痕比對照組厚度較薄,術(shù)后45 d時(shí)間點(diǎn)其SEI在