HDAC參與瘢痕疙瘩形成的作用及機制研究.pdf

1、瘢痕疙瘩是皮膚創(chuàng)傷后引發(fā)的以成纖維細胞異常增殖并分泌大量細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)為主要特征的一種皮膚纖維化疾病,治療效果不佳,復(fù)發(fā)率較高,發(fā)病機制尚不清楚。近年來研究發(fā)現(xiàn),組蛋白去乙?；?histone deacetylase,HDAC)活性增高與多種組織和器官纖維化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),使用HDAC抑制劑降低HDAC活性可抑制皮膚正常成纖維細胞ECM的合成。同時HDAC活性增高還是多種腫瘤發(fā)生的病

2、理機制,使用HDAC抑制劑可以通過激活凋亡信號,使異常增殖的腫瘤細胞生長停滯,誘導(dǎo)其凋亡。所以我們也推測HDAC活性增加可能與瘢痕疙瘩成纖維細胞的增殖和分泌大量 ECM密切相關(guān)。本課題將研究 I型HDAC(HDAC1和HDAC2)在瘢痕疙瘩成纖維細胞中的表達情況,并使用 HDAC抑制劑TSA進行體內(nèi)和體外實驗進行干預(yù),以期闡明I型HDAC是如何參與瘢痕疙瘩形成的病理機制,為HDAC抑制劑類藥物臨床應(yīng)用預(yù)防和治療瘢痕疙瘩提供理論基礎(chǔ)。

3、r>　　實驗一 HDAC1和HDAC2在瘢痕疙瘩成纖維細胞中表達的實驗研究
　　目的:本實驗旨在研究I型HDAC(HDAC1和HDAC2)在瘢痕疙瘩成纖維細胞中的表達情況,并與正常皮膚成纖維細胞相比較,以期為瘢痕疙瘩提供新的發(fā)病機制,及治療的新切入點。
　　方法:我們首先進行瘢痕疙瘩成纖維細胞與正常皮膚成纖維細胞原代培養(yǎng)。接著通過RT-PCR和western blot方法檢測HDAC1和HDAC2在瘢痕疙瘩成纖維細胞中的表達

4、情況,并與正常皮膚成纖維細胞相比較。
　　結(jié)果:我們通過 RT-PCR方法檢測發(fā)現(xiàn),瘢痕疙瘩成纖維細胞 HDAC1和 HDAC2 mRNA的表達均比正常皮膚成纖維細胞明顯增高。接著,用western blot方法檢測同樣證實瘢痕疙瘩成纖維細胞HDAC1和HDAC2蛋白的表達也均比正常皮膚成纖維細胞要高。
　　結(jié)論:我們的研究證實HDAC1和HDAC2在瘢痕疙瘩成纖維細胞中的表達明顯增高。HDAC1和HDAC2的活性增強,可以

5、使原有的基因表達平衡狀態(tài)被打破,從而導(dǎo)致細胞增殖、凋亡和纖維化等生物學(xué)特征的異常,這可能是瘢痕疙瘩成纖維細胞過度增殖并合成大量ECM的病理新機制。
　　實驗二 HDAC抑制劑TSA誘導(dǎo)瘢痕疙瘩成纖維細胞凋亡的實驗研究
　　目的:HDAC抑制劑TSA可以引起多種惡性增殖的細胞生長停滯,促進其發(fā)生凋亡,本實驗旨在研究 TSA是否可以誘導(dǎo)瘢痕疙瘩成纖維細胞發(fā)生凋亡及 TSA對細胞HDAC1和HDAC2蛋白表達的影響。
　　方

6、法:首先,我們向培養(yǎng)的瘢痕疙瘩成纖維細胞加入不同濃度的HDAC抑制劑TSA(200 nmol/L、400 nmol/L、600 nmol/L和800 nmol/L),運用MTT法檢測TSA對細胞活力的影響。然后,通過Hoechst染色和流式細胞儀檢測TSA誘導(dǎo)瘢痕疙瘩成纖維細胞發(fā)生凋亡的作用。最后,運用western blot方法檢測TSA對瘢痕疙瘩成纖維細胞HDAC1和HDAC2蛋白表達的影響。
　　結(jié)果:通過MTT法檢測TSA

7、對細胞增殖的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著濃度和時間的變化, TSA抑制細胞的增殖存在量效性和時效性的特點。成纖維細胞對于200 nmol/L TSA作用耐受性良好,在600 nmol/L和800 nmol/L TSA作用下,細胞活力明顯下降。隨后600 nmol/L TSA單獨作用瘢痕疙瘩成纖維細胞,通過Hoechst染色和流式細胞儀檢測同樣證實TSA可以誘導(dǎo)瘢痕疙瘩成纖維細胞發(fā)生凋亡。最后,運用western blot方法檢測發(fā)現(xiàn)600 nmo

8、l/L TSA處理瘢痕疙瘩成纖維細胞48 h后,瘢痕疙瘩成纖維細胞HDAC1和HDAC2蛋白的表達明顯受到了抑制。
　　結(jié)論:我們的研究證實HDAC抑制劑TSA可以抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖,誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡,這可能是通過抑制HDAC1和HDAC2的表達來實現(xiàn)的。
　　實驗三 HDAC抑制劑TSA抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞膠原合成的實驗研究
　　目的:本實驗旨在研究HDAC抑制劑TSA是否可以抑制TGF-β促瘢痕疙瘩成纖維細

9、胞膠原合成的作用。
　　方法:我們分別通過RT-PCR和western blot方法檢測600 nmol/L TSA單獨作用或者聯(lián)合5 ng/ml TGF-β1蛋白對瘢痕疙瘩成纖維細胞I型膠原(collagen I)mRNA和蛋白表達的影響。
　　結(jié)果:通過RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn),向培養(yǎng)的瘢痕疙瘩成纖維細胞加入5 ng/ml TGF-β1,可以促進細胞 collagen I mRNA合成,而同時加入600 nmol/L TSA

10、后,可以抑制TGF-β1促進細胞collagen I mRNA合成的作用。單獨使用600 nmol/L TSA后這種抑制作用會更加顯著。Western blot方法檢測同樣證實TSA可以抑制細胞collagen I蛋白的合成。
　　結(jié)論:我們的研究證實HDAC抑制劑TSA可以抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞膠原合成,這就為這種已經(jīng)在臨床治療多種腫瘤的HDAC抑制劑應(yīng)用于瘢痕疙瘩臨床預(yù)防和治療提供實驗基礎(chǔ)。
　　實驗四 HDAC抑制劑T

11、SA抑制兔耳增生性瘢痕形成的實驗研究
　　目的:已證實HDAC抑制劑TSA能夠有效抑制體外培養(yǎng)的皮膚成纖維細胞膠原合成而起到抗纖維化作用,本部分實驗擬通過兔耳增生性瘢痕模型驗證TSA是否能夠在體內(nèi)實驗抑制瘢痕的形成。
　　方法:建立兔耳增生性瘢痕模型。每個兔耳做4個直徑為1 cm,間距為2 cm的圓形全層皮膚缺損創(chuàng)面。每只兔的左耳為TSA治療組,分別在創(chuàng)面上皮化后創(chuàng)面局部注射TSA,每個創(chuàng)面使用0.02％TSA0.05 ml

12、。連續(xù)注射1周。右耳為對照組,分別在相同時間點局部注射相同劑量生理鹽水0.05 ml。術(shù)后第23 d收集瘢痕標(biāo)本,進行RT-PCR和western blot檢測collagen I和纖維連接蛋白(fibronectin)mRNA和蛋白的表達情況。術(shù)后第45 d收集瘢痕標(biāo)本,行 HE染色切片計算瘢痕增生指數(shù)(scar elevation index,SEI)。
　　結(jié)果:TSA治療組瘢痕比對照組厚度較薄,術(shù)后45 d時間點其SEI在