黃芪甲苷地缺血心肌促血管新生作用及其與miRNA-21關(guān)系研究.pdf

1、目的：研究黃芪甲苷(AS-Ⅳ)對(duì)缺血心肌組織以及體外培養(yǎng)EA-hy926細(xì)胞中VEGF及miR-21表達(dá)的影響，探討AS-Ⅳ誘導(dǎo)血管新生與miR-21的關(guān)系。
　　方法：⑴將24只急性心肌梗死大鼠模型分為:模型組、AS-Ⅳ低劑量組、AS-Ⅳ高劑量組，每組8只，及假手術(shù)組（8只）。術(shù)后次日起AS-Ⅳ低劑量組灌服30mg/kg/d，AS-Ⅳ高劑量組灌服100mg/kg/d，模型組和假手術(shù)組大鼠灌胃等量蒸餾水。連續(xù)給藥14天后，每組取4

2、只經(jīng)結(jié)扎點(diǎn)位置橫斷心臟，剪取心肌梗死及周圍區(qū)域，放入到4％多聚甲醛液中固定，作HE染色及免疫組化檢測(cè)微血管（CD34標(biāo)記）和微動(dòng)脈形成（α-SMA標(biāo)記）;另每組取4只，作心肌梗死范圍測(cè)定，Western Blot檢測(cè)VEGF，RT-PCR檢測(cè)VEGF mRNA、miR-21的表達(dá)情況；⑵以不同濃度AS-Ⅳ（10μmol/L、30μmol/L、100μmol/L）孵育EA-hy926細(xì)胞48小時(shí)，以空白作對(duì)照;Western Blot法檢

3、測(cè)細(xì)胞中VEGF水平;RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中miR-21、VEGFmRNA表達(dá)；⑶用脂質(zhì)體Lipofectamine2000將miR-21 mimic、miR-21 inhibitor轉(zhuǎn)染EA-hy926細(xì)胞，分為對(duì)照組(negtive control)、AS-Ⅳ（100μmol/L）組、miR-21mimic組、miR-21 inhibitor組及AS-Ⅳ（100μmol/L）+miR-21 inhibitor組，孵育48小時(shí)。Wes

4、tern Blot法檢測(cè)細(xì)胞中VEGF及p-Akt蛋白表達(dá)水平;RT-PCR檢測(cè)VEGF mRNA及Akt mRNA水平;CCK8法測(cè)定細(xì)胞增殖;以基質(zhì)膠管腔形成實(shí)驗(yàn)來評(píng)估體外血管新生情況。
　　結(jié)果：①AS-Ⅳ組心肌組織梗死面積百分比均低于心肌梗死模型組(P＜0.05)，且AS-Ⅳ高劑量治療組低于AS-Ⅳ低劑量治療組(P＜0.05);AS-Ⅳ組心肌梗死周邊區(qū)微血管數(shù)量及密度高于心肌梗死對(duì)照組，且AS-Ⅳ高劑量治療組高于AS-Ⅳ低

5、劑量治療組（P＜0.05）;AS-Ⅳ治療組VEGF蛋白表達(dá)高于心肌梗死對(duì)照組(P＜0.05)，且AS-Ⅳ高劑量治療組高于AS-Ⅳ低劑量治療組(P＜0.05); AS-Ⅳ能提高心肌梗死周邊區(qū)miR-21、VEGF mRNA表達(dá)量(P＜0.05)。②體外實(shí)驗(yàn)表明AS-Ⅳ(10μmol/L)組、AS-Ⅳ(30μmol/L)組、AS-Ⅳ(100μmol/L)組與模型組比較，VEGF蛋白表達(dá)均有顯著差異(P＜0.05)。100μmol/L黃芪甲苷

6、可達(dá)到最大促VEGF蛋白表達(dá)作用。同時(shí)AS-Ⅳ（100μmo l/L）可達(dá)到最大的促VEGF相關(guān)mRNA，miR21表達(dá)作用。③AS-Ⅳ(100μmol/L)、miR-21mimic組VEGF mRNA、AKT mRNA水平較對(duì)照組明顯升高(P＜0.05)，而在miR-21 inhibitor、AS-Ⅳ（100μmol/L）+miR-21 inhibitor組，與對(duì)照組比較，VEGF mRNA、AKT mRNA水平明顯下降（P＜0.05

7、），但是miR-21 inhibitor未能將黃芪甲苷作用完全抑制，而兩組之間亦無顯著性差異（P＞0.05）;VEGF、p-AKT蛋白表達(dá)亦得出類似結(jié)果。AS-Ⅳ（100μmol/L）、miR-21mimic組較對(duì)照組細(xì)胞增殖明顯加快(P＜0.05)，而兩組之間無明顯差異（P＞0.05）;在miR-21inhibitor、AS-Ⅳ(100μmol/L)+miR-21 inhibitor組，與對(duì)照組比較，細(xì)胞增殖明顯下降（P＜0.05），