基于血管新生與成熟的Hif-1α信號機制揭示黃芪甲苷IV治療心肌梗死的新機制.pdf

1、缺血性心臟疾病是嚴(yán)重威脅著人類健康,其病理特點是血管的狹窄或阻塞,導(dǎo)致病理血管附近的心肌組織缺血壞死?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對于缺血性心臟病的治療重在快速建立有效循環(huán),挽救可逆性心肌組織,最大程度的保護(hù)心臟的“泵血”能力,降低致死率。目前,由于經(jīng)皮冠脈內(nèi)介入治療、冠狀動脈旁路移植術(shù)等治療有創(chuàng)傷性,以及在彌漫性病變患者中上述治療方法存在局限性,治療性血管再生術(shù)已成為治療缺血性疾病領(lǐng)域的研究新方向。雖然大量臨床和基礎(chǔ)實驗的都在不斷提高治療性血管再生術(shù)的療

2、效,但其療效的穩(wěn)定性、安全性以及可操作性、藥物性價比都是擺在研究者面前的難題。
　　按照中醫(yī)理論對心梗病理病機的認(rèn)識,心氣虛是其最常見和最早出現(xiàn)的證候。有學(xué)者認(rèn)為不同程度的心肌梗死患者都有心氣虛存在,心功能低下與心氣虛密切相關(guān)。黃芪甲苷IV是從傳統(tǒng)益氣中藥黃芪中提取的一種皂苷類的單體,是黃芪的主要有效成分,且被廣泛應(yīng)用于治療缺血性疾病。且有學(xué)者通過體外血管內(nèi)皮細(xì)胞實驗已初步證實黃芪甲苷IV可通過活化PI3K-AKT信號通路激活Hi

3、f-1α,從而促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和體外管腔的形成。但黃芪甲苷IV治療心肌梗死的作用、對血管新生與成熟的影響以及其與Hif-1α機制的相關(guān)性尚不明確。據(jù)此,故本實驗以益氣法理論為基礎(chǔ),采用中西醫(yī)結(jié)合的思考路線,研究具有益氣藥功效的黃芪的有效成分黃芪甲苷IV是否通過上調(diào)Hif-1α的表達(dá)促進(jìn)心梗周邊組織血管的新生和成熟來促進(jìn)心梗的恢復(fù)。我們的研究旨在為治療性血管再生術(shù)的研究開辟新視角。
　　實驗一黃芪甲苷IV對心肌梗死小鼠的治療作

4、用
　　1.目的
　　研究黃芪甲苷IV對心肌梗死小鼠的治療作用。
　　2.方法
　　(1)建立小鼠心梗模型后,每日腹腔注射給藥,并記錄小鼠生命體征,21天后通過小鼠心動超檢測小鼠心功能的變化.
　　(2)Masson三色染色法檢測心肌梗死后小鼠的心肌纖維化的程度。
　　(3)CD31、α-SMA熒光染色觀察梗死周邊心肌組織新生血管的變化.
　　(4)鼠尾注射生物標(biāo)記素Lectin后取材切片行熒光

5、染色觀察梗死周邊心肌組織新生血管的灌注情況。
　　(5)Western blot檢測心肌組織Hif-1α和VEGF蛋白表達(dá)的變化。
　　3.結(jié)果
　　(1)黃芪甲苷IV對小鼠心功能的影響:心動超聲圖提示:與心梗對照組比較,每日腹腔注射黃芪甲苷IV可提高心梗小鼠的左心射血分?jǐn)?shù)(61±2.7％)和左心室短軸收縮率(44±.3.2%),且差異具有明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。
　　(2)黃芪甲苷IV對小鼠心肌纖維化的

6、影響:與心梗對照組纖維化面積(17.5±2.3%)比較,每日腹腔注射黃芪甲苷IV治療組小鼠心肌纖維化面積(7.8±2.4%)減小,且差異具有明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。
　　(3)黃芪甲苷IV對心梗組織周邊新生血管的影響:與心梗對照組比較,每日腹腔注射黃芪甲苷IV可顯著提高CD31陽性的小血管的密度(214±21.3/mm2)以及有平滑肌細(xì)胞被覆的CD31和α-SMA雙陽性的成熟血管的密度(7±2.1/mm2)且差異具有明顯統(tǒng)

7、計學(xué)意義(P<0.01)。
　　(4)黃芪甲苷IV對心梗周邊心肌組織中血管灌注能力的影響:與心梗對照組(0.19±0.07×104/pixels)比較,每日腹腔注射黃芪甲苷IV可顯著提高生物標(biāo)記素Lectin陽性的有灌注能力的血管密度(0.39±0.11×104/pixels),且差異具有明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。
　　(5)黃芪甲苷IV對心梗后心肌組織Hif-1α和VEGF蛋白表達(dá)的影響:與心梗組比較,黃芪甲苷IV可

8、上調(diào)梗死周邊心肌組織Hif-1α和VEGF蛋白的表達(dá),且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。
　　4.結(jié)論
　　(1)黃芪甲苷IV治療后可提高小鼠的左心射血分?jǐn)?shù)和左心室短軸收縮率,提高心臟功能,減小心梗小鼠心肌纖維化程度。
　　(2)黃芪甲苷IV治療后可增加梗死心肌周邊心肌組織新生血管的密度及有平滑肌細(xì)胞被覆的成熟血管的密度,且可提高有灌溉能力的血管密度。
　　(3)黃芪甲苷IV可促進(jìn)梗死心肌周邊組織中Hif-1

9、α和VEGF蛋白的表達(dá)。
　　實驗二黃芪甲苷IV對缺氧內(nèi)皮細(xì)胞活性和形成管腔能力的影響
　　1.目的
　　觀察黃芪甲苷IV對缺氧內(nèi)皮細(xì)胞活性和形成管腔能力的影響。
　　2.方法
　　(1)MTT檢測不同濃度黃芪甲苷IV對缺氧內(nèi)皮細(xì)胞活性的影響。
　　(2)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步檢測黃芪甲苷IV對缺氧內(nèi)皮細(xì)胞周期和凋亡的影響。
　　(3)體外平面管腔實驗檢測黃芪甲苷IV對缺氧內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成能力的影響。

10、三維磁珠管腔形成實驗進(jìn)一步檢測黃芪甲苷 IV對缺氧內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成能力的影響。
　　(4)Western blot檢測黃芪甲苷IV對缺氧內(nèi)皮細(xì)胞Hif-1α和VEGF蛋白表達(dá)的影響。
　　3.結(jié)果
　　(1)不同濃度黃芪甲苷IV在對缺氧臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活性的影響:從0.125μΜ到0.5μΜ隨著濃度的提高,與對照組相比,黃芪甲苷IV可提高缺氧內(nèi)皮細(xì)胞的活性,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。
　　(2)黃芪甲苷

11、IV對缺氧臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞增殖和凋亡的影響:與對照組比較,黃芪甲苷IV處理組缺氧血管內(nèi)皮細(xì)胞處于G2和S期的比值明顯增大,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);且與對照組比較,黃芪甲苷IV處理組缺氧的血管內(nèi)皮細(xì)胞中早期凋亡和晚期凋亡的細(xì)胞比例數(shù)都明顯減少,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。
　　(3)黃芪甲苷IV對缺氧臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成能力的影響:缺氧條件下,缺氧組內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成能力明顯下降,但在黃芪甲苷IV處理后,缺

12、氧血管內(nèi)皮細(xì)胞形成管腔的數(shù)量(18±3.1/field)明顯提高,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。且三維管腔形成實驗進(jìn)一步提示:與對照組比較,在黃芪甲苷IV處理后,缺氧內(nèi)皮細(xì)胞通過出芽形成管腔的密度(7±1.7/beads)明顯提高,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。
　　(4)黃芪甲苷IV對缺氧臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞Hif-1α和VEGF蛋白表達(dá)的影響:與對照組比較,黃芪甲苷IV處理組可顯著提高缺氧內(nèi)皮細(xì)胞Hif-1α和VEG

13、F蛋白的表達(dá),差異具有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。
　　4.結(jié)論
　　(1)黃芪甲苷IV可抑制缺氧內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡,促進(jìn)其增殖。
　　(2)黃芪甲苷IV可促進(jìn)缺氧內(nèi)皮細(xì)胞形成血管管腔。
　　(3)黃芪甲苷IV在可上調(diào)缺氧內(nèi)皮細(xì)胞Hif-1α和VEGF蛋白的表達(dá)。
　　實驗三黃芪甲苷IV抑制缺血心肌細(xì)胞損傷的Hif-1α信號機制
　　1.目的
　　研究黃芪甲苷IV抑制缺血心肌細(xì)胞損傷的Hif-

14、1α信號機制。
　　2.方法
　　(1)原代心肌細(xì)胞的提取和培養(yǎng);LDH的測定黃芪甲苷IV和Hif-1αsiRNA對缺血心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。
　　(2)流式細(xì)胞術(shù)檢測黃芪甲苷IV和Hif-1α siRNA對缺血心肌細(xì)胞的凋亡的影響。
　　(3)Quantitative PCR和Western blot檢測黃芪甲苷IV和Hif-1αsiRNA對缺血心肌細(xì)胞Hif-1α和VEGF蛋白表達(dá)水平的影響。
　　3.結(jié)

15、果
　　(1)黃芪甲苷IV對缺血心肌細(xì)胞凋亡的影響:與缺血對照組(34.3±3.7%)比較,黃芪甲苷IV處理組后,缺血心肌細(xì)胞的凋亡可減少(17.8±2.8%),且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);對細(xì)胞進(jìn)行Hif-1αsiRNA轉(zhuǎn)染后,與轉(zhuǎn)染非特異siRNA對照組比較,缺血細(xì)胞的凋亡有增加趨勢,但差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義。但在加入黃芪甲苷IV處理后,與轉(zhuǎn)染Hif-1αsiRNA(35.6±3.4%%)對照組比較,缺血細(xì)胞的凋亡無明

16、顯減少,且差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　(2)黃芪甲苷IV對缺血心肌細(xì)胞LDH釋放量的影響:與缺血對照組比較,黃芪甲苷IV處理組可降低LDH釋放,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);對細(xì)胞進(jìn)行Hif-1αsiRNA轉(zhuǎn)染后,與轉(zhuǎn)染非特異siRNA對照組比較,缺血細(xì)胞的LDH釋放有增加趨勢,但差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義,但在加入黃芪甲苷IV處理后,與轉(zhuǎn)染Hif-1αsiRNA對照組比較,LDH釋放無明顯減少,且差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　

17、　(3)黃芪甲苷IV對缺血心肌細(xì)胞Hif-1α和VEGF mRNA和蛋白表達(dá)的影響:與缺血對照組比較,黃芪甲苷IV處理組可上調(diào)Hif-1α和VEGF mRNA和蛋白,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。對細(xì)胞進(jìn)行Hif-1αsiRNA轉(zhuǎn)染后,與轉(zhuǎn)染非特異siRNA對照組比較,Hif-1α和VEGF mRNA和蛋白明顯下調(diào),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),而且在加入黃芪甲苷IV處理后,與轉(zhuǎn)染Hif-1α siRNA對照組比較,Hif-