HIF-1α介導(dǎo)黃芪甲苷后處理抗心肌缺血再灌注損傷作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景:目前治療急性冠脈綜合癥、心肌梗死和心絞痛的主要方法是重新恢復(fù)缺血心肌組織血液供應(yīng)。盡管可以有效改善心肌組織血液供應(yīng),但常常繼發(fā)缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury,I/RI),是導(dǎo)致心臟手術(shù)患者術(shù)后心力衰竭發(fā)病率升高、并發(fā)癥發(fā)生和死亡率上升最重要的原因。修復(fù)I/RI后的心肌組織和恢復(fù)心臟功能已成為臨床上心血管治療過(guò)程中亟待解決的問(wèn)題。但由于IR/I的病理機(jī)制復(fù)雜,有很多信號(hào)通路和細(xì)胞因子參與其中,

2、因此尚未獲得有效的保護(hù)治療方法。最新的研究報(bào)道表明,芪甲苷(Astragaloside IV,As IV)在多種實(shí)驗(yàn)條件下可以拮抗大腦、腎臟、肝臟、視網(wǎng)膜和皮膚的缺血再灌注損傷。黃芪甲苷的這種拮抗缺血再灌注損傷的保護(hù)作用已經(jīng)在許多動(dòng)物模型上得到證實(shí)和報(bào)道。然而,黃芪甲苷后處理對(duì)缺血再灌注損傷的心肌細(xì)胞是否具有保護(hù)作用尚需進(jìn)一步研究。有報(bào)道提出,低氧誘導(dǎo)因子-1α(Hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)表達(dá)

3、水平升高是在分子水平對(duì)抗心肌細(xì)胞缺血的首要反應(yīng)之一。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),HIF-1α在缺血預(yù)處理可以充當(dāng)中介作用,且HIF-1α的藥理穩(wěn)定性在非毒性條件下有拮抗心臟急性缺血再灌注損傷的作用。其它研究表明,后處理可以減少梗死面積,減弱凋亡,以及上調(diào)HIF-1α的表達(dá)。有報(bào)道稱(chēng)黃芪甲苷可以通過(guò)磷脂酰肌醇3-蛋白激酶 B（phosphatidylinositol3-kinase/protein kinase B,PI3K/Akt)通路促進(jìn)血管生成,

4、提高HIF-1α的積聚。然而,HIF-1α在黃芪甲苷后處理拮抗心肌缺血再灌注損傷過(guò)程中是否扮演重要角色尚需進(jìn)一步研究。
　　目的:在離體心臟和心肌細(xì)胞水平探索As IV后處理對(duì)心肌I/RI的保護(hù)作用,以及研究Hif-1α以及下游iNOS基因在黃芪甲苷后處理心肌保護(hù)作用過(guò)程中所扮演的角色。
　　方法:實(shí)驗(yàn)一,以2-MeOE2特異性阻斷Hif-1α信號(hào)通路的表達(dá),應(yīng)用Langendoff離體心灌注系統(tǒng)建立離體心臟缺血再灌注損傷模

5、型,研究黃芪甲苷后處理在心肌缺血再灌注損傷過(guò)程中的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)分組:將48只SD大鼠隨機(jī)分為5組,每組8只:分別為空白對(duì)照(Control)組、I/R組、I/R+As IV組、I/R+As IV+2-MeOE2組和I/R+2-MeOE2組。SD大鼠的腹腔注射適量戊巴比妥(25mg/kg)和肝素(400U/kg),待大鼠昏迷后,迅速開(kāi)胸取下心臟,放入預(yù)先準(zhǔn)備的冷KH緩沖液(4℃)中凍停,主動(dòng)脈根部,迅速固定于 Langendorff離體

6、心灌注系統(tǒng)灌注管口,將恒溫(37℃)恒壓(80mmHg)的KH緩沖液逆行灌注到離體心內(nèi),按分組進(jìn)行灌注。Control組不加任何處理持續(xù)灌注150分鐘,I/R組、I/R+As IV組、I/R+2-MeOE2組和I/R+As IV+2-MeOE2組停止灌注90分鐘,然后復(fù)灌60分鐘,模擬建立離體心缺血再灌注損傷;I/R+As IV組、I/R+2-MeOE2和I/R+As IV+2-MeOE2組在復(fù)灌前分別用用含實(shí)驗(yàn)濃度As IV、As I

7、V+2-MeOE2和2-MeOE2灌注液在37℃溫度,80mmHg壓力下持續(xù)灌注10分鐘;全程監(jiān)測(cè)各組心臟血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo),包括心率(HR)、左心室內(nèi)壓(+dp/dt max)、左心室發(fā)展壓(LVDP);用帶有刻度的試管分別在復(fù)灌后第15分鐘、30分鐘、45分鐘和60分鐘接冠脈流出液(CF)1分鐘并記錄。灌流結(jié)束后,取下心臟,氯化三苯基四氮唑(TTC)法測(cè)定心肌梗死面積(MI);乳酸脫氫酶(LDH)專(zhuān)用試劑盒檢測(cè)冠脈流出液(CF)中LDH

8、釋放量,LDH釋放量的多少可以反應(yīng)心肌細(xì)胞死亡數(shù)量的多少;原位末端標(biāo)記(TUNEL)法檢測(cè)心肌組織細(xì)胞凋亡率;West-blot檢測(cè)各組心肌蛋白Hif-1α、iNOS、Bac-2和Caspase-3表達(dá)水平。
　　實(shí)驗(yàn)二,取2-3天的健康初生乳鼠心肌細(xì)胞,培養(yǎng)3～4天后按實(shí)驗(yàn)所需密度平均分為5組:分別為空白對(duì)照(Control)組、SI/RI組、SI/RI+As IV組、SI/RI+As IV+2-MeOE2組和SI/RI+2-M

9、eOE2組。各組細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)要求處理后,噻唑藍(lán)(MTT)染色法檢測(cè)細(xì)胞各組心肌細(xì)胞存活率;原位末端標(biāo)記法(TUNEL)染色法和流式細(xì)胞分析法檢測(cè)心肌組織凋亡率和細(xì)胞所處周期狀態(tài)。超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)專(zhuān)用試劑盒檢測(cè)各組培養(yǎng)液內(nèi)超氧化物歧化酶和丙二醛的含量;West-blot檢測(cè)各組心肌細(xì)胞Hif-1α、iNOS、抗凋亡因子Bac-2和促凋亡因子Caspase-3表達(dá)水平。
　　結(jié)果:實(shí)驗(yàn)一,與Control組相比

10、,I/R組離體心臟復(fù)灌后各時(shí)間點(diǎn)左心室內(nèi)壓(+dp/dt max)和左心室發(fā)展壓(LVDP)均顯著降低(P<0.01),心臟梗死面積(MI)顯著增大(P<0.01),LDH釋放量顯著升高(P<0.01),TUNEL染色結(jié)果顯示心肌細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.01)。與I/R組相比,I/R+As IV組心臟復(fù)灌后各時(shí)間點(diǎn)左心室內(nèi)壓(+dp/dt max)和左心室發(fā)展壓(LVDP)均顯著升高(P<0.01),心臟梗死面積(MI)顯著減少(P

11、<0.01),LDH釋放量顯著減少(P<0.01),TUNEL染色法結(jié)果顯示心肌細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.01),且呈濃度依賴(lài)性,在50μM濃度保護(hù)作用最明顯。加入2-MeOE2后可顯著抑制黃芪甲苷在心肌缺血再灌注損傷過(guò)程中的保護(hù)作用,表現(xiàn)在心臟復(fù)灌后各時(shí)間點(diǎn)左心室內(nèi)壓(+dp/dt max)和左心室發(fā)展壓(LVDP)顯著降低(P<0.01),心臟梗死面積(MI)顯著增大(P<0.01),LDH釋放量顯著增多(P<0.01),TUNE

12、L染色結(jié)果顯示心肌細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.01)。與 I/R組相比,I/R+2-MeOE2組各項(xiàng)指標(biāo)無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。West-blot結(jié)果顯示,與Control組相比,I/R組Hif-1α、iNOs表達(dá)下降(P<0.05),抗凋亡蛋白 Bcl-2表達(dá)顯著降低(P<0.01),促凋亡蛋白 Caspase-3顯著升高(P<0.01)。與I/R組相比,I/R+As IV組Hif-1α、iNOs表達(dá)顯著上升(P<0.01)

13、,抗凋亡蛋白 Bcl-2顯著升高(P<0.01),促凋亡蛋白 Caspase-3顯著降低(P<0.01)。與I/R+As IV組相比,I/R+As IV+2-MeOE2組Hif-1α、iNOs表達(dá)顯著下降(P<0.01),抗凋亡蛋白 Bcl-2表達(dá)顯著降低(P<0.01),促凋亡蛋白 Caspase-3顯著升高(P<0.01)。與I/R組相比,I/R+2-MeOE2組各檢測(cè)蛋白表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　實(shí)驗(yàn)二,與 C

14、ontrol組相比,SI/RI組的細(xì)胞存活率和粘附率顯著下降,凋亡率顯著上升(P<0.01)。與SI/RI組相比,SI/RI+As IV各濃度處理組細(xì)胞存活率和粘附率顯著上升,凋亡率顯著下降(P<0.01),且呈濃度依賴(lài)依賴(lài)效應(yīng),在50μM濃度下保護(hù)作用最為明顯。與SI/RI+As IV組相比,加入2-MeOE2后可顯著抑制黃芪甲苷的保護(hù)作用,表現(xiàn)為細(xì)胞存活率和粘附率顯著下降,凋亡率顯著上升(P<0.01)。各組細(xì)胞培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(

15、LDH)含量檢測(cè)結(jié)果顯示,與 Control組相比,SI/RI組細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH含量顯著升高(P<0.01);與SI/RI組相比,SI/RI+As IV組細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH含量顯著降低(P<0.01);與SI/RI+As IV組相比,SI/RI+As IV+2-MeOE2組細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH含量顯著升高(P<0.01)。與SI/RI組相比,I/R+2-MeOE2組各項(xiàng)指標(biāo)無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。West-blot結(jié)果顯示,與

16、 Control組相比,I/R組Hif-1α、iNOs表達(dá)下降(P<0.05),抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)顯著降低(P<0.01),促凋亡蛋白Caspase-3顯著升高(P<0.01)。與I/R組相比,I/R+As IV組Hif-1α、iNOs表達(dá)顯著上升(P<0.01),抗凋亡蛋白Bcl-2顯著升高(P<0.01),促凋亡蛋白Caspase-3顯著降低(P<0.01)。與I/R+As IV組相比,I/R+As IV+2-MeOE2組Hi

17、f-1α、iNOs表達(dá)顯著下降(P<0.01),抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)顯著降低(P<0.01),促凋亡蛋白Caspase-3顯著升高(P<0.01)。與I/R組相比,I/R+2-MeOE2組各檢測(cè)蛋白表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　結(jié)論:As IV后處理對(duì)離體心和乳鼠心肌細(xì)胞I/RI具有顯著的保護(hù)作用,Hif-1α信號(hào)通路以及下游通路iNOS在As IV后處理保護(hù)作用過(guò)程中扮演重要角色,黃芪甲苷通過(guò)上調(diào)Hif-1α信號(hào)通