8-氧乙酰山梔酸甲酯抗腦缺血及促血管新生研究.pdf

1、中風(fēng)與癌癥、心血管疾病被認(rèn)為是主要導(dǎo)致人死亡的原因之一,嚴(yán)重危害人們的健康。腦中風(fēng)是一種嚴(yán)重的神經(jīng)性疾病,是一個(gè)復(fù)雜多變的病理生理過(guò)程,其發(fā)病機(jī)理目前尚未完全闡明,目前提出的病理機(jī)制有興奮性氨基酸中毒、炎癥反應(yīng)、氧化損傷、代謝性酸中毒、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、線粒體損傷,細(xì)胞凋亡、免疫炎癥損傷、離子失衡、減少缺血半暗帶的神經(jīng)細(xì)胞死亡、神經(jīng)保護(hù)等學(xué)說(shuō)。根據(jù)這些學(xué)說(shuō)和機(jī)制而采取的治療措施以及研制的治療藥物,到目前為止尚未獲得滿意的療效。1995,美國(guó)

2、FDA批準(zhǔn)的抗腦卒中治療藥物NINDS rt-PA在卒中發(fā)生后3 h內(nèi)使用可明顯改善中風(fēng)3個(gè)月時(shí)的功能恢復(fù),但卒中發(fā)生后3 h內(nèi)使用是其最大的缺陷。隨后發(fā)展的治療藥物尿激酶原(溶栓藥)在6h內(nèi)動(dòng)脈給予可明顯改善中風(fēng)的功能恢復(fù),而中風(fēng)發(fā)作超過(guò)3-6h若使用上述溶栓藥后可導(dǎo)致腦內(nèi)出血和腦水腫,而通?；颊咴诎l(fā)生腦卒中后的3-6h內(nèi)并不能及時(shí)到達(dá)醫(yī)院接受上述治療,所以患者能接受溶栓治療的幾率相對(duì)較低,不到5％。上述溶栓藥只在中風(fēng)發(fā)作6h之內(nèi)使用

3、,大大限制了其應(yīng)用。因此,尋找一個(gè)安全有效的既能用于腦卒中早期治療,又能用于后期功能恢復(fù)的藥物很有必要。迄今為止尚無(wú)符合上述條件的理想治療藥物。8-氧乙酰山梔酸甲酯(ND01)是山東省天然藥物工程技術(shù)研究中心研究人員從中藥獨(dú)一味Lamiophlomisrotata(Benth.)Kudo.莖葉中提取分離出來(lái)的一種環(huán)烯醚萜化合物。前期對(duì)8-氧乙酰山梔酸甲酯在腦血管疾病方向進(jìn)行了藥理學(xué)篩選,結(jié)果顯示具有較好的藥理活性,擬開(kāi)發(fā)為治療缺血性腦中

4、風(fēng)的藥物。本文研究了ND01對(duì)缺血性腦損傷的保護(hù)作用及腦缺血后的促血管新生作用,并探討了對(duì)缺血性腦損傷以及腦缺血后促血管新生的可能的作用機(jī)制。
　　一、ND01對(duì)缺糖和缺氧損傷的新生鼠皮層神經(jīng)元的保護(hù)作用
　　以培養(yǎng)的新生鼠皮層神經(jīng)元制備缺糖和缺氧損傷模型,觀察給予一定濃度的ND01對(duì)神經(jīng)元存活、線粒體抗氧化酶、線粒體呼吸酶和呼吸功能、細(xì)胞LDH漏出、細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]j及凋亡的影響,結(jié)果表明給予濃度為3-81μM的ND01

5、對(duì)新生鼠皮層神經(jīng)元缺糖-缺氧損傷有明顯的保護(hù)作用,能明顯降低神經(jīng)元凋亡及壞死神經(jīng)元的百分率,減少LDH的漏出,抑制細(xì)胞[Ca2+]I水平的升高,改善線粒體能量代謝。
　　二、ND01對(duì)全腦缺血大鼠腦損傷的保護(hù)作用
　　結(jié)扎大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈90分鐘,再通22.5 h,制備大鼠的全腦缺血再灌損傷模型,觀察靜脈注射給予ND01對(duì)全腦缺血大鼠腦損傷的神經(jīng)保護(hù)作用,結(jié)果表明ND0110 mg/kg、20 mg/kg靜脈給藥顯著降低全腦

6、缺血大鼠神經(jīng)細(xì)胞的壞死和凋亡,且具有明顯的劑量依賴關(guān)系。
　　三、ND01對(duì)大鼠局部腦缺血損傷的保護(hù)作用
　　線栓法制作大鼠中動(dòng)脈栓塞模型,觀察靜脈注射給予ND01對(duì)大鼠中動(dòng)脈栓塞導(dǎo)致的局部腦缺血大鼠腦損傷的神經(jīng)保護(hù)作用,結(jié)果表明ND0110 mg/kg、20 mg/kg靜脈注射給藥明顯減小局灶性腦缺血大鼠缺血24h和7天時(shí)的腦梗死面積,減輕神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能障礙,明顯減輕腦水腫程度。
　　四、ND01對(duì)大鼠腦缺血再灌損傷的

7、劑量.效應(yīng)、治療時(shí)間窗及長(zhǎng)期作用研究
　　線栓法制作大鼠中動(dòng)脈栓塞模型,腦缺血1.5 h后再灌注,觀察靜脈注射N(xiāo)D01對(duì)大鼠腦缺血再灌損傷的劑量.效應(yīng)、治療時(shí)間窗及長(zhǎng)期作用。量效關(guān)系結(jié)果分析顯示,ND01單次靜脈注射超過(guò)10 mg/kg能夠顯著改善缺血導(dǎo)致的神經(jīng)行為缺陷,增加缺血區(qū)的腦神經(jīng)元存活數(shù)量;單次靜脈注射40 mg/kg以上改善缺血導(dǎo)致的神經(jīng)行為缺陷更顯著,缺血區(qū)的存活神經(jīng)元數(shù)量明顯多于10 mg/kg和20 mg/kg,

8、提示隨著ND01劑量的增加藥效明顯增強(qiáng)。治療時(shí)間窗分析顯示,再灌30 min、1 h、3 h、5 h后單次靜脈注射20 mg/kg能夠顯著改善缺血導(dǎo)致的神經(jīng)行為缺陷,增加缺血區(qū)的腦神經(jīng)元存活數(shù)量:但再灌7 h單次靜脈注射20 mg/kg不能改善缺血導(dǎo)致的神經(jīng)行為缺陷,缺血區(qū)的腦神經(jīng)元存活數(shù)量亦未明顯多于模型組,提示隨著時(shí)間延長(zhǎng),給予ND01藥效明顯減弱。長(zhǎng)期治療作用分析顯示,再灌30min單次靜脈注射20 mg/kg能夠顯著改善造模第3

9、天、第7天和第14天缺血導(dǎo)致的神經(jīng)行為缺陷,增加缺血第14天時(shí)缺血區(qū)的腦神經(jīng)元存活數(shù)量,提示靜脈給予一定劑量的ND01具有明顯的長(zhǎng)期神經(jīng)保護(hù)作用。
　　五、ND01對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞體外增殖、遷移及血管生成的作用
　　以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞為研究對(duì)象,SRB法測(cè)定細(xì)胞增殖,劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力以及膠原基質(zhì)膠三維培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞檢測(cè)體外血管生成能力,結(jié)果給予濃度為9-81μM的ND01明顯增加人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞增殖能力和遷移能

10、力,另外血管樣結(jié)構(gòu)生成能力亦明顯增強(qiáng)。
　　六、ND01對(duì)局部腦缺血再灌大鼠血管新生的作用
　　栓線法制作大鼠中動(dòng)脈栓塞再灌損傷模型,缺血24h后靜脈給予ND01,觀察ND01對(duì)缺血再灌大鼠促血管新生的作用,結(jié)果ND015 mg/kg、10 mg/kg靜脈給藥7天和14天明顯改善缺血再灌大鼠的神經(jīng)行為缺陷,促進(jìn)缺血再灌大鼠缺血區(qū)的血管新生,增加再灌大鼠缺血區(qū)VEGF、Ang1和Tie2蛋白表達(dá),同時(shí)增加缺血再灌大鼠缺血區(qū)磷酸

11、化Akt和磷酸化Tie2表達(dá),而且未增加缺血再灌大鼠血腦屏障通透性,提示ND01促腦缺血大鼠血管新生可能通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路。
　　結(jié)論:ND01對(duì)體外缺糖-缺氧損傷神經(jīng)元具有明顯的保護(hù)作用;對(duì)動(dòng)物缺血性腦損傷具有明確的保護(hù)作用且具有明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系、治療時(shí)間窗及長(zhǎng)期作用,體內(nèi)和體外研究結(jié)果顯示均促進(jìn)血管新生。抑制Ca2+超載和凋亡、改善線粒體能量代謝是ND01發(fā)揮其抗急性腦缺血的可能機(jī)制,通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路