內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)控肝細(xì)胞表達(dá)受體相互作用蛋白激酶3(RIP3)的機(jī)制研究.pdf

1、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)是真核細(xì)胞中參與蛋白質(zhì)的翻譯、加工修飾、儲(chǔ)存和運(yùn)輸?shù)闹饕?xì)胞器。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是細(xì)胞內(nèi)、外環(huán)境改變，錯(cuò)誤蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)聚積致功能紊亂的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)病理狀態(tài)。ERS可通過激活未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)抑制錯(cuò)誤蛋白翻譯和指導(dǎo)錯(cuò)誤蛋白正確折疊修飾，進(jìn)而恢復(fù)或減輕ERS。ERS參與

2、酒精性和非酒精性肝病、藥物性急性肝衰、肝缺血再灌注肝損等急慢性肝病的發(fā)生與發(fā)展。RIP3(receptor-interacting protein3)被認(rèn)為是細(xì)胞壞死與RIP1介導(dǎo)凋亡途徑的開關(guān)蛋白，當(dāng)RIP3被激活后RIP1介導(dǎo)的凋亡向細(xì)胞壞死轉(zhuǎn)化，決定著細(xì)胞轉(zhuǎn)歸。研究表明，RIP3介導(dǎo)的壞死也參與酒精性和非酒精性肝病、藥物性急性肝衰、肝缺血再灌注肝損等肝病的發(fā)生與發(fā)展。但少有文獻(xiàn)研究ERS是否直接調(diào)控RIP3的表達(dá)及相關(guān)機(jī)制。本研究

3、主要通過體內(nèi)外激活ERS探索RIP3表達(dá)變化及其機(jī)制。方法:利用人肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞株L02和人肝星狀細(xì)胞株LX-2分別建立ERS模型，探討ERS調(diào)控RIP3的表達(dá)機(jī)制及其在急性肝損傷中的作用。利用ERS激活劑毒胡蘿卜素(TG)和衣霉素(TM)分別建立ERS模型，ERS抑制劑4-苯基丁酸鈉(4-PBA)和Salubrinal分別緩解ERS;利用STF-083010(STF)特異性抑制Inositol-requiring enzyme l(IRE

4、1α)核酸內(nèi)切酶激酶活性（RNase）;小干擾RNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞株分別敲低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)元件雙鏈RNA依賴的蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(Protein kinase-like ER kinase，PERK)、X-box-binding protein1(XBP1)、激活轉(zhuǎn)錄因子(Activating transcription factor-6，ATF6)和RIP3的表達(dá)水平;通過反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和免疫印跡（Western b

5、loting）實(shí)驗(yàn)檢測RNA和蛋白表達(dá)，通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞壞死率和細(xì)胞周期，通過Cell-counting kit-8(CCK8)檢測細(xì)胞總壞死率;利用TG和STF小鼠腹腔注射分別建立藥物性急性肝損傷模型，血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)肝酶、蘇木素-伊紅(HE)染色和Tunel染色確定肝損程度，RT-PCR、Western bloting和免疫組化染色體內(nèi)驗(yàn)證ERS對(duì)RIP3的調(diào)控作用;最后收集14例急性或亞急

6、性病毒性肝炎肝衰肝移植病例和14例肝海綿狀血管瘤手術(shù)切除病例，免疫組化染色分析ERS的激活和RIP3的表達(dá)。結(jié)果:在L02和LX-2兩株細(xì)胞株中，TG和TM分別成功的誘導(dǎo)了ERS，同時(shí)RIP3和磷酸化的RIP3(p-RIP3)高表達(dá);ERS誘導(dǎo)L02和LX-2細(xì)胞壞死和抑制LX-2細(xì)胞增殖，穩(wěn)定敲低RIP3表達(dá)后可緩解ERS的不良作用;4-PBA在緩解ERS同時(shí)抑制RIP3的高表達(dá)，小干擾敲低PERK表達(dá)和Salubrinal抑制p-e