2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、目的: 近年來,肝細胞損傷尤其是肝細胞凋亡過度在肝纖維化發(fā)病機制中的作用受到了廣泛關注。有研究證實肝細胞凋亡增加不僅是肝臟疾病早期損傷的重要病理改變,也是肝纖維化、肝硬化等病變形成的基本條件。因此,深入闡明肝纖維化時肝細胞凋亡的分子機制對肝纖維化及肝硬化的防治具有十分重要的意義。目前的研究認為細胞凋亡除通過死亡受體和線粒體依賴的凋亡通路介導外,內質網應激也介導了該過程,且與肝纖維化的發(fā)生有一定的聯系。但是關于內質網應激介導肝細胞凋亡的具

2、體分子機制目前仍不清楚,尤其是內質網應激介導凋亡過程中關鍵信號分子Caspase12的活化機制尚未完全闡明,推測可能與鈣蛋白酶Calpain的活化及對Caspase12的水解有關。由于Caspase12特異定位于細胞內質網外膜,是內質網應激介導凋亡的特異性通路蛋白,因此了解和闡明 Caspase12的活化機制可能對揭示肝細胞內質網應激誘導細胞凋亡的信號通路及深入闡明肝纖維化的發(fā)生機制提供理論基礎?;谏鲜鲅芯勘尘埃緦嶒灢捎肅Cl4誘導

3、的大鼠肝纖維化動物模型和體外培養(yǎng)的經二硫蘇糖醇誘導內質網應激的肝細胞為研究對象,觀察鈣蛋白酶 Calpain2和其抑制蛋白 Calpastatin以及內質網應激介導細胞凋亡過程中關鍵信號分子 Caspase12在肝細胞中的表達變化,并深入探討它們在肝纖維化發(fā)生過程中內質網應激介導的肝細胞凋亡機制中的可能作用。
  方法: 本實驗首先采用皮下注射40% CCl4植物油溶液復制大鼠肝纖維化動物模型,通過肝組織病理學檢查以及血清生化指標

4、ALT、AST檢測判斷肝纖維化動物模型是否成功;應用Real-time PCR檢測大鼠肝組織中GRP78、Calpain2、Calpastatin及 Caspase12 mRNA的表達水平;采用免疫組織化學法及Western Blot檢測大鼠肝組織中GRP78、Calpain2、Calpastatin、Caspase12、Caspase3的表達定位及表達水平改變;同時采用TUNEL法檢測大鼠肝細胞凋亡情況。其次,采用二硫蘇糖醇誘導體外培

5、養(yǎng)的肝細胞發(fā)生內質網應激反應,應用Real-time PCR檢測 DTT誘導內質網應激后肝細胞內 GRP78、Calpain2、Calpastatin及Caspase12 mRNA的表達水平;采用細胞免疫熒光技術及Western Blot測定肝細胞內GRP78、Calpain2、Calpastatin、Caspase12及Caspase3的表達變化;同時還應用激光共聚焦和流式細胞儀檢測肝細胞胞漿內游離Ca2+水平及肝細胞凋亡情況。為進一

6、步明確內質網應激介導肝細胞凋亡的分子機制,本研究采用Calpain2 siRNA轉染體外培養(yǎng)的肝細胞,觀察在 Calpain2基因沉默的情況下,內質網應激介導細胞凋亡過程中關鍵信號分子Caspase12的活性變化及肝細胞凋亡的改變。
  結果: 本實驗結果顯示,肝纖維化4周、8周組大鼠肝臟指數、血清ALT、AST濃度均高于相應的正常對照組;肝組織病理學檢查發(fā)現,肝纖維化4周組大鼠肝細胞脂肪樣變明顯,匯管區(qū)可見少量纖維結締組織增生;

7、肝纖維化8周組大鼠肝細胞脂肪樣變嚴重,肝小葉結構破壞,匯管區(qū)纖維結締組織大量增生,可見假小葉形成,表明本實驗成功地復制了肝纖維化大鼠動物模型。采用Real-time PCR檢測肝組織GRP78、Calpain2、Calpastatin及Caspase12 mRNA的結果顯示,肝纖維化4周組大鼠肝組織中GRP78、Calpain2及Caspase12 mRNA的表達顯著高于正常對照組大鼠,而Calpastatin mRNA的表達與正常對照

8、組比較無顯著性差異;到肝纖維化8周時,肝組織中GRP78、Calpain2、Caspase12 mRNA的表達仍保持在高水平;而Calpastatin mRNA的表達則較正常8周組大鼠顯著降低。通過免疫組化和Western Blot對各指標蛋白水平的檢測發(fā)現,肝纖維化4周時,大鼠肝組織中Calpain2、Calpastatin的表達與正常4周組比較無顯著差異,而GRP78、Procaspase12、活性Caspase12及活性Caspa

9、se3的表達則顯著增加;到肝纖維化8周時,肝組織中Calpain2的表達較正常8周組明顯增多,同時GRP78、Procaspase12、活性Caspase12及活性Caspase3的表達仍保持在高水平,而Calpastatin的表達則較正常8周組顯著減少。TUNEL法檢測肝細胞凋亡的結果顯示,肝纖維化4周及8周組大鼠肝細胞凋亡率均較正常對照組顯著增加。體外培養(yǎng)的BRL-3A細胞經DTT處理6 h、12 h、24 h后,內質網應激標志蛋白

10、GRP78在基因及蛋白水平的表達逐步增加,說明我們用DTT誘導肝細胞內質網應激是成功的。Real-time PCR檢測結果顯示體外培養(yǎng)的肝細胞經DTT處理6 h后,肝細胞內Calpain2及Caspase12 mRNA的表達已較正常對照組細胞顯著升高;至DTT處理12 h及24 h后,肝細胞內Calpain2及Caspase12 mRNA的表達仍保持在較高水平。而肝細胞內Calpastatin mRNA的表達在DTT處理6 h及12 h

11、后未發(fā)生顯著變化;至DTT處理24 h時,肝細胞內Calpastatin mRNA的表達才較正常對照組顯著增高。Western blot及細胞免疫熒光檢測發(fā)現隨著DTT刺激時間的延長,肝細胞內Calpain2、Procaspase12、活性Caspase12及活性Caspase3蛋白的表達均較正常對照組顯著增高;而肝細胞內Calpastatin蛋白的表達在DTT處理24 h后才較正常對照組細胞顯著增加。同時采用流式細胞儀檢測肝細胞凋亡發(fā)

12、現隨著DTT刺激時間的延長肝細胞凋亡是逐步增多的。此外采用激光共聚焦檢測發(fā)現,DTT處理體外培養(yǎng)的肝細胞12 h及24 h后,肝細胞胞漿內游離 Ca2+顯著高于正常對照組。本研究進一步對 Calpain2及內質網的表達共定位研究發(fā)現,DTT處理12 h及24 h組肝細胞內Calpain2表達與內質網分布的重疊程度明顯增高,說明在內質網應激狀態(tài)下,Calpain2可能移位到了內質網上。為進一步闡明Calpain2在內質網應激介導的細胞凋亡

13、中的作用,本研究采用小干擾RNA技術沉默體外培養(yǎng)的肝細胞中的Calpain2基因,然后再用DTT處理Calpain2基因沉默的肝細胞24 h,結果發(fā)現肝細胞中活性Caspase12蛋白的表達明顯降低,同時用流式細胞儀檢測肝細胞凋亡也顯著減少。
  結論: (1)CCl4誘導大鼠肝纖維化發(fā)生過程中存在肝細胞內質網應激反應,在內質網應激狀態(tài)下,Caspase12信號通路的活化可能是導致肝細胞凋亡增加的環(huán)節(jié)之一;(2)肝纖維化時,Cal

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