Calpain2及其抑制蛋白Calpastatin在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡中的作用.pdf

1、目的: 近年來(lái),肝細(xì)胞損傷尤其是肝細(xì)胞凋亡過(guò)度在肝纖維化發(fā)病機(jī)制中的作用受到了廣泛關(guān)注。有研究證實(shí)肝細(xì)胞凋亡增加不僅是肝臟疾病早期損傷的重要病理改變,也是肝纖維化、肝硬化等病變形成的基本條件。因此，深入闡明肝纖維化時(shí)肝細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制對(duì)肝纖維化及肝硬化的防治具有十分重要的意義。目前的研究認(rèn)為細(xì)胞凋亡除通過(guò)死亡受體和線(xiàn)粒體依賴(lài)的凋亡通路介導(dǎo)外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激也介導(dǎo)了該過(guò)程，且與肝纖維化的發(fā)生有一定的聯(lián)系。但是關(guān)于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡的具

2、體分子機(jī)制目前仍不清楚，尤其是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)凋亡過(guò)程中關(guān)鍵信號(hào)分子Caspase12的活化機(jī)制尚未完全闡明，推測(cè)可能與鈣蛋白酶Calpain的活化及對(duì)Caspase12的水解有關(guān)。由于Caspase12特異定位于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外膜，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)凋亡的特異性通路蛋白，因此了解和闡明 Caspase12的活化機(jī)制可能對(duì)揭示肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路及深入闡明肝纖維化的發(fā)生機(jī)制提供理論基礎(chǔ)?；谏鲜鲅芯勘尘?，本實(shí)驗(yàn)采用CCl4誘導(dǎo)

3、的大鼠肝纖維化動(dòng)物模型和體外培養(yǎng)的經(jīng)二硫蘇糖醇誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的肝細(xì)胞為研究對(duì)象，觀(guān)察鈣蛋白酶 Calpain2和其抑制蛋白 Calpastatin以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)細(xì)胞凋亡過(guò)程中關(guān)鍵信號(hào)分子 Caspase12在肝細(xì)胞中的表達(dá)變化，并深入探討它們?cè)诟卫w維化發(fā)生過(guò)程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡機(jī)制中的可能作用。
　　方法: 本實(shí)驗(yàn)首先采用皮下注射40％ CCl4植物油溶液復(fù)制大鼠肝纖維化動(dòng)物模型，通過(guò)肝組織病理學(xué)檢查以及血清生化指標(biāo)

4、ALT、AST檢測(cè)判斷肝纖維化動(dòng)物模型是否成功；應(yīng)用Real-time PCR檢測(cè)大鼠肝組織中GRP78、Calpain2、Calpastatin及 Caspase12 mRNA的表達(dá)水平；采用免疫組織化學(xué)法及Western Blot檢測(cè)大鼠肝組織中GRP78、Calpain2、Calpastatin、Caspase12、Caspase3的表達(dá)定位及表達(dá)水平改變；同時(shí)采用TUNEL法檢測(cè)大鼠肝細(xì)胞凋亡情況。其次，采用二硫蘇糖醇誘導(dǎo)體外培

5、養(yǎng)的肝細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，應(yīng)用Real-time PCR檢測(cè) DTT誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后肝細(xì)胞內(nèi) GRP78、Calpain2、Calpastatin及Caspase12 mRNA的表達(dá)水平；采用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)及Western Blot測(cè)定肝細(xì)胞內(nèi)GRP78、Calpain2、Calpastatin、Caspase12及Caspase3的表達(dá)變化；同時(shí)還應(yīng)用激光共聚焦和流式細(xì)胞儀檢測(cè)肝細(xì)胞胞漿內(nèi)游離Ca2+水平及肝細(xì)胞凋亡情況。為進(jìn)一

6、步明確內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，本研究采用Calpain2 siRNA轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的肝細(xì)胞，觀(guān)察在 Calpain2基因沉默的情況下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)細(xì)胞凋亡過(guò)程中關(guān)鍵信號(hào)分子Caspase12的活性變化及肝細(xì)胞凋亡的改變。
　　結(jié)果: 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，肝纖維化4周、8周組大鼠肝臟指數(shù)、血清ALT、AST濃度均高于相應(yīng)的正常對(duì)照組；肝組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，肝纖維化4周組大鼠肝細(xì)胞脂肪樣變明顯，匯管區(qū)可見(jiàn)少量纖維結(jié)締組織增生；

7、肝纖維化8周組大鼠肝細(xì)胞脂肪樣變嚴(yán)重，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，匯管區(qū)纖維結(jié)締組織大量增生，可見(jiàn)假小葉形成，表明本實(shí)驗(yàn)成功地復(fù)制了肝纖維化大鼠動(dòng)物模型。采用Real-time PCR檢測(cè)肝組織GRP78、Calpain2、Calpastatin及Caspase12 mRNA的結(jié)果顯示，肝纖維化4周組大鼠肝組織中GRP78、Calpain2及Caspase12 mRNA的表達(dá)顯著高于正常對(duì)照組大鼠，而Calpastatin mRNA的表達(dá)與正常對(duì)照

8、組比較無(wú)顯著性差異；到肝纖維化8周時(shí)，肝組織中GRP78、Calpain2、Caspase12 mRNA的表達(dá)仍保持在高水平；而Calpastatin mRNA的表達(dá)則較正常8周組大鼠顯著降低。通過(guò)免疫組化和Western Blot對(duì)各指標(biāo)蛋白水平的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，肝纖維化4周時(shí)，大鼠肝組織中Calpain2、Calpastatin的表達(dá)與正常4周組比較無(wú)顯著差異，而GRP78、Procaspase12、活性Caspase12及活性Caspa

9、se3的表達(dá)則顯著增加；到肝纖維化8周時(shí)，肝組織中Calpain2的表達(dá)較正常8周組明顯增多，同時(shí)GRP78、Procaspase12、活性Caspase12及活性Caspase3的表達(dá)仍保持在高水平，而Calpastatin的表達(dá)則較正常8周組顯著減少。TUNEL法檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡的結(jié)果顯示，肝纖維化4周及8周組大鼠肝細(xì)胞凋亡率均較正常對(duì)照組顯著增加。體外培養(yǎng)的BRL-3A細(xì)胞經(jīng)DTT處理6 h、12 h、24 h后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白

10、GRP78在基因及蛋白水平的表達(dá)逐步增加，說(shuō)明我們用DTT誘導(dǎo)肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是成功的。Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示體外培養(yǎng)的肝細(xì)胞經(jīng)DTT處理6 h后，肝細(xì)胞內(nèi)Calpain2及Caspase12 mRNA的表達(dá)已較正常對(duì)照組細(xì)胞顯著升高；至DTT處理12 h及24 h后，肝細(xì)胞內(nèi)Calpain2及Caspase12 mRNA的表達(dá)仍保持在較高水平。而肝細(xì)胞內(nèi)Calpastatin mRNA的表達(dá)在DTT處理6 h及12 h

11、后未發(fā)生顯著變化；至DTT處理24 h時(shí)，肝細(xì)胞內(nèi)Calpastatin mRNA的表達(dá)才較正常對(duì)照組顯著增高。Western blot及細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)隨著DTT刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，肝細(xì)胞內(nèi)Calpain2、Procaspase12、活性Caspase12及活性Caspase3蛋白的表達(dá)均較正常對(duì)照組顯著增高；而肝細(xì)胞內(nèi)Calpastatin蛋白的表達(dá)在DTT處理24 h后才較正常對(duì)照組細(xì)胞顯著增加。同時(shí)采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡發(fā)

12、現(xiàn)隨著DTT刺激時(shí)間的延長(zhǎng)肝細(xì)胞凋亡是逐步增多的。此外采用激光共聚焦檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，DTT處理體外培養(yǎng)的肝細(xì)胞12 h及24 h后，肝細(xì)胞胞漿內(nèi)游離 Ca2+顯著高于正常對(duì)照組。本研究進(jìn)一步對(duì) Calpain2及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的表達(dá)共定位研究發(fā)現(xiàn)，DTT處理12 h及24 h組肝細(xì)胞內(nèi)Calpain2表達(dá)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分布的重疊程度明顯增高，說(shuō)明在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下，Calpain2可能移位到了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。為進(jìn)一步闡明Calpain2在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡

13、中的作用，本研究采用小干擾RNA技術(shù)沉默體外培養(yǎng)的肝細(xì)胞中的Calpain2基因，然后再用DTT處理Calpain2基因沉默的肝細(xì)胞24 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞中活性Caspase12蛋白的表達(dá)明顯降低，同時(shí)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡也顯著減少。
　　結(jié)論: （1）CCl4誘導(dǎo)大鼠肝纖維化發(fā)生過(guò)程中存在肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下，Caspase12信號(hào)通路的活化可能是導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡增加的環(huán)節(jié)之一；（2）肝纖維化時(shí)，Cal