新型CDK7抑制劑對膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)功能的影響.pdf

1、目的：膠質(zhì)瘤呈浸潤性生長，具有高度侵襲性，惡性膠質(zhì)瘤患者病死率高，并且缺乏有效的治療手段。新型CDK7抑制劑THZ1含有一個(gè)丙烯酰胺結(jié)構(gòu)，能共價(jià)結(jié)合到傳統(tǒng)激酶區(qū)域外的半胱氨酸殘基上，是首個(gè)被報(bào)道的共價(jià)不可逆CDK抑制劑。THZ1在小細(xì)胞肺癌、三陰性乳腺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、T細(xì)胞急淋和其他造血系統(tǒng)腫瘤中顯示了較好療效，其能夠抑制多種癌基因的轉(zhuǎn)錄，阻滯細(xì)胞周期進(jìn)展，抑制增殖，誘發(fā)凋亡。本研究探討THZ1對人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87及U251的增殖、

2、凋亡、侵襲能力的影響及細(xì)胞周期的阻滯作用，進(jìn)一步探索THZ1的功能及其抗膠質(zhì)瘤的可能機(jī)制。
　　方法：將U87及U251細(xì)胞分成空白組、對照組及實(shí)驗(yàn)組，對于U87細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組分別采用終濃度為25nmol/L、50nmol/L、100 nmol/L、200nmol/L、400nmol/L的THZ1進(jìn)行處理，對于U251細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組分別采用終濃度為5nmol/L、10 nmol/L、20nmol/L、40nmol/L、80nmol/L的

3、THZ1進(jìn)行處理，空白組為加入等量的DMEM完全培養(yǎng)基，溶劑對照組（DMSO組）為含THZ1工作液中等量的DMSO的DMEM完全培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的THZ1處理后，以CCK-8法及平板克隆形成試驗(yàn)分析細(xì)胞增殖;Transwell侵襲試驗(yàn)觀測各組侵襲能力的變化;流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞周期分布及凋亡情況;Western blot實(shí)驗(yàn)檢測凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3的表達(dá)量。
　　結(jié)果：1.THZ1抑制U87及U251的增殖，

4、72小時(shí)藥物IC50，U87細(xì)胞為83.1nmol/L、U251細(xì)胞為13.7nmol/L。平板克隆形成試驗(yàn)結(jié)果顯示對照組克隆形成率為(55.26±8.81)％，5nmol/L處理組的克隆形成率為(19.34±3.41)％，與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.586，P＜0.01)，10nmol/L處理組未見明顯克隆形成，結(jié)果顯示低劑量THZ1即可明顯抑制U251細(xì)胞的單克隆形成率。
　　2.膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87具有較強(qiáng)的侵襲能力，

5、通過體外transwell侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對照組細(xì)胞數(shù)為134±13個(gè)，50nmol/L處理組細(xì)胞數(shù)為72±7個(gè)，與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.141，P＜0.01)，給予50nmol/L THZ1處理24小時(shí)后，其侵襲能力明顯減弱。所以，THZ1能明顯的降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲性。
　　3.THZ1促進(jìn)U251細(xì)胞凋亡，Caspase-3表達(dá)增加。對照組凋亡率為(8.3±2.5)％，THZ1處理10nmol/L組凋亡率為(15

6、.6±3.7)％，20nmol/L組凋亡率為(39.7±6.0)％，凋亡率隨著THZ1濃度的升高而增加。實(shí)驗(yàn)組與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t分別為2.832和8.367，P＜0.05)。Western blot結(jié)果顯示，凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3表達(dá)隨著THZ1濃度升高而明顯增加。
　　4.THZ1阻滯U87及U251細(xì)胞周期進(jìn)展，G2期細(xì)胞顯著增加。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示使用濃度為25、50、100nmol/L的THZ1

7、處理U87細(xì)胞24h后，G2期隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞比例逐漸增加，(分別為31.26±1.97、34.09±2.09、41.22±2.40)與對照組(17.95±2.83)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。同樣，使用濃度為5、10、20nmol/L的THZ1處理U251細(xì)胞24h后，G2期隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞比例逐漸增加，(分別為9.27±2.01、41.35±0.73、56.92±0.69)與對照組(16.17±1.99)比