miR-29c通過胰島素樣生長因子1抑制人血管內(nèi)皮細胞遷移和血管生成的研究.pdf

1、第一部分 miR-29c對血管形成相關轉(zhuǎn)錄因子表達的影響
　　目的:探討miR-29c對血管形成相關轉(zhuǎn)錄因子表達的影響。
　　方法：培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs），并構建miR-29C mimics和miR-29C inhibitor轉(zhuǎn)染。通過Real-time PCR檢測miRNA轉(zhuǎn)染后相關因子mRNA的表達，Western Blot檢測miRNA轉(zhuǎn)染后相關因子蛋白的表達，免疫熒光檢測VEGF表達。
　　結果：

2、人臍靜脈內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)染miR-29c模擬物造成PI3K，AKT和VEGF mRNA和蛋白表達水平的顯著下降(P<0.01)，但IGF-1僅表現(xiàn)為蛋白水平下降，mRNA表達卻無明顯改變(P>0.05)。免疫熒光細胞組化檢測結果顯示，人臍靜脈內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)染 miR-29c模擬物能明顯抑制VEGF表達(P<0.05)，而轉(zhuǎn)染 miR-29c抑制劑組 VEGF表達增強(P<0.05)。
　　結論：miR-29c能夠抑制血管形成相關轉(zhuǎn)錄因子 P

3、I3K、AKT和VEGF的mRNA和蛋白表達。同時，miR-29c能下調(diào)IGF-1的蛋白表達，但不影響其mRNA表達，提示其對IGF-1的作用為轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)，即翻譯抑制。
　　第二部分 miR-29c對人臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖、遷移及血管形成能力的影響
　　目的:探討miR-29c對人臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖活性、遷移能力及血管形成能力的影響。
　　方法：人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）培養(yǎng)并轉(zhuǎn)染。通過 MTT、EdU檢測轉(zhuǎn)染對細

4、胞增殖能力影響，流式細胞分析術檢測細胞周期變化，Transwell檢測細胞的遷移能力變化，小管形成實驗檢測細胞的血管形成能力變化。
　　結果：在人臍靜脈內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)染miR-29c模擬物組，HUVECs和293-T細胞的增殖率分別下降了57.6％和36.3%，與空白組對照有顯著性差異（P<0.05）；轉(zhuǎn)染miR-29c模擬物組與其余組比較，DNA合成S期的細胞數(shù)量最少，進入G2期的細胞數(shù)量最多，HUVECs增殖活性明顯下降，HUVE

5、Cs遷徙能力明顯減弱，較空白對照組下降了31%，較轉(zhuǎn)染 miR-29c抑制劑組下降64%；細胞血管生成能力顯著下降，生成血管的直徑較小且成環(huán)率降低（P<0.05）。轉(zhuǎn)染miR-29c抑制劑組與其余組比較，DNA合成S期的細胞數(shù)量最多，HUVECs增殖活性明顯增強，HUVECs遷徙能力明顯增強，細胞血管生成能力也有加強（P<0.05）。
　　結論：miR-29c能抑制HUVECs的增殖活性、細胞移行及血管形成，這可能由于 miR-2

6、9c的表達對內(nèi)皮細胞生長因子的信號通路有影響，進而影響了細胞的生物學行為。
　　第三部分 miR-29c抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞血管生成的分子機制研究
　　目的:探討miR-29c抑制血管形成能力的機制。
　　方法：培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）后進行miRNA靶向基因的生物學預測。通過構建IGF-13’UTR端熒光素酶質(zhì)粒后進行熒光素酶報告基因檢測及細胞劃痕實驗研究 miR-29c抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞血管生成的分子

7、機制。
　　結果：miR-29c模擬物能明顯降低IGF-13′UTR螢光素酶報告基因的熒光強度（P<0.05）；但是卻不能降低IGF-13′UTR突變組螢光素酶報告基因的熒光強度（P>0.05）。當加入miR-29c抑制物后，IGF-13′UTR螢光素酶報告基因的熒光強度明顯增加（P<0.05），但突變較對照組沒有明顯變化（P>0.05）。細胞劃痕24h后，轉(zhuǎn)染miRNA-29c mimics的人臍靜脈內(nèi)皮細胞（ HUVECs）組

8、劃痕愈合的速度明顯弱于轉(zhuǎn)染miRNA-29c inhibitor的人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）（P<0.01，圖3.3、3.4）；當轉(zhuǎn)染miRNA-29c mimics的人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）加入IGF-1后，劃痕愈合的速度明顯增加（P<0.05），提示IGF-1拯救了miRNA-29c導致的人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）遷徙能力降低的現(xiàn)象。
　　結論：IGF-1/PI3K/AKT/VEGF途徑可以調(diào)節(jié)血管的生成，