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文檔簡介
1、第一部分 miR-29c對血管形成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達的影響
目的:探討miR-29c對血管形成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達的影響。
方法:培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs),并構(gòu)建miR-29C mimics和miR-29C inhibitor轉(zhuǎn)染。通過Real-time PCR檢測miRNA轉(zhuǎn)染后相關(guān)因子mRNA的表達,Western Blot檢測miRNA轉(zhuǎn)染后相關(guān)因子蛋白的表達,免疫熒光檢測VEGF表達。
結(jié)果:
2、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-29c模擬物造成PI3K,AKT和VEGF mRNA和蛋白表達水平的顯著下降(P<0.01),但IGF-1僅表現(xiàn)為蛋白水平下降,mRNA表達卻無明顯改變(P>0.05)。免疫熒光細(xì)胞組化檢測結(jié)果顯示,人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染 miR-29c模擬物能明顯抑制VEGF表達(P<0.05),而轉(zhuǎn)染 miR-29c抑制劑組 VEGF表達增強(P<0.05)。
結(jié)論:miR-29c能夠抑制血管形成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子 P
3、I3K、AKT和VEGF的mRNA和蛋白表達。同時,miR-29c能下調(diào)IGF-1的蛋白表達,但不影響其mRNA表達,提示其對IGF-1的作用為轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié),即翻譯抑制。
第二部分 miR-29c對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及血管形成能力的影響
目的:探討miR-29c對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性、遷移能力及血管形成能力的影響。
方法:人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)培養(yǎng)并轉(zhuǎn)染。通過 MTT、EdU檢測轉(zhuǎn)染對細(xì)
4、胞增殖能力影響,流式細(xì)胞分析術(shù)檢測細(xì)胞周期變化,Transwell檢測細(xì)胞的遷移能力變化,小管形成實驗檢測細(xì)胞的血管形成能力變化。
結(jié)果:在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-29c模擬物組,HUVECs和293-T細(xì)胞的增殖率分別下降了57.6%和36.3%,與空白組對照有顯著性差異(P<0.05);轉(zhuǎn)染miR-29c模擬物組與其余組比較,DNA合成S期的細(xì)胞數(shù)量最少,進入G2期的細(xì)胞數(shù)量最多,HUVECs增殖活性明顯下降,HUVE
5、Cs遷徙能力明顯減弱,較空白對照組下降了31%,較轉(zhuǎn)染 miR-29c抑制劑組下降64%;細(xì)胞血管生成能力顯著下降,生成血管的直徑較小且成環(huán)率降低(P<0.05)。轉(zhuǎn)染miR-29c抑制劑組與其余組比較,DNA合成S期的細(xì)胞數(shù)量最多,HUVECs增殖活性明顯增強,HUVECs遷徙能力明顯增強,細(xì)胞血管生成能力也有加強(P<0.05)。
結(jié)論:miR-29c能抑制HUVECs的增殖活性、細(xì)胞移行及血管形成,這可能由于 miR-2
6、9c的表達對內(nèi)皮細(xì)胞生長因子的信號通路有影響,進而影響了細(xì)胞的生物學(xué)行為。
第三部分 miR-29c抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞血管生成的分子機制研究
目的:探討miR-29c抑制血管形成能力的機制。
方法:培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)后進行miRNA靶向基因的生物學(xué)預(yù)測。通過構(gòu)建IGF-13’UTR端熒光素酶質(zhì)粒后進行熒光素酶報告基因檢測及細(xì)胞劃痕實驗研究 miR-29c抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞血管生成的分子
7、機制。
結(jié)果:miR-29c模擬物能明顯降低IGF-13′UTR螢光素酶報告基因的熒光強度(P<0.05);但是卻不能降低IGF-13′UTR突變組螢光素酶報告基因的熒光強度(P>0.05)。當(dāng)加入miR-29c抑制物后,IGF-13′UTR螢光素酶報告基因的熒光強度明顯增加(P<0.05),但突變較對照組沒有明顯變化(P>0.05)。細(xì)胞劃痕24h后,轉(zhuǎn)染miRNA-29c mimics的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞( HUVECs)組
8、劃痕愈合的速度明顯弱于轉(zhuǎn)染miRNA-29c inhibitor的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)(P<0.01,圖3.3、3.4);當(dāng)轉(zhuǎn)染miRNA-29c mimics的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)加入IGF-1后,劃痕愈合的速度明顯增加(P<0.05),提示IGF-1拯救了miRNA-29c導(dǎo)致的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)遷徙能力降低的現(xiàn)象。
結(jié)論:IGF-1/PI3K/AKT/VEGF途徑可以調(diào)節(jié)血管的生成,
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