互花米草谷胱甘肽合成及還原酶相關(guān)基因的克隆和功能鑒定.pdf

1、鹽脅迫是影響植物生長(zhǎng)和發(fā)育的重要非生物脅迫因子，它能引起次級(jí)脅迫-滲透脅迫和氧化脅迫。植物在脅迫下可以利用抗氧化系統(tǒng)清除活性氧，從而保護(hù)細(xì)胞和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。近年來，研究者在鹽生植物中鑒定了大量與耐鹽相關(guān)的基因，并進(jìn)行了功能驗(yàn)證。研究表明，谷胱甘肽還原酶GR作為抗氧化酶在植物耐鹽機(jī)制中發(fā)揮了重要作用。
　　為研究泌鹽鹽生植物互花米草（Spartina alterniflora）谷胱甘肽合成酶相關(guān)基因（SaOAS）及還原酶相關(guān)基因（Sa

2、GRC、SaGRP）的功能，本研究首先分析了互花米草幼苗在600 mmol/L NaCl和500μmmol/L CdCl2脅迫下葉片中谷胱甘肽還原酶GR的活性變化；其次，克隆出谷胱甘肽還原酶基因SaGRC、SaGRP和半胱氨酸合成酶基因SaOAS，構(gòu)建過量表達(dá)載體后利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化擬南芥和水稻，并對(duì)獲得的陽性純合轉(zhuǎn)基因擬南芥株系進(jìn)行相關(guān)生理生化測(cè)定和耐鹽性分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　　(1)脅迫處理對(duì)谷胱甘肽含量和谷胱甘肽還原酶活

3、性的影響
　　分別用600 mmol/L NaCl和500μmmol/L CdCl2處理互花米草幼苗，結(jié)果顯示，隨著處理時(shí)間的增加，還原性谷胱甘肽含量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。與此同時(shí)，谷胱甘肽還原酶活性呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，與非變性的聚丙烯酰氨凝膠電泳顯示的總體活性相一致。
　　(2)基因的克隆和序列分析
　　利用3’-RACE和5’-RACE技術(shù)獲得目的基因SaGRC、SaGRP、SaOAS，其中SaGRC為胞質(zhì)型，SaGRP為線粒體

4、型，兩者序列同源性很高。SaGRC基因的開放閱讀框?yàn)?479 bp，推導(dǎo)其編碼492個(gè)氨基酸殘基，SaGRP基因的開放閱讀框?yàn)?659 bp，推導(dǎo)其編碼532個(gè)氨基酸殘基。SaOAS基因的開放閱讀框?yàn)?69 bp，推導(dǎo)編碼322個(gè)氨基酸殘基。
　　(3)基因表達(dá)水平的變化
　　分別用600 mmol/L NaCl和500μmmol/L CdCl2處理互花米草幼苗，結(jié)果顯示，SaGRC、SaGRP、SaOAS基因的表達(dá)量均呈現(xiàn)

5、先上升后下降的趨勢(shì)，推測(cè)GR在互花米草抗逆機(jī)制中發(fā)揮重要作用。
　　(4)轉(zhuǎn)基因擬南芥生理檢測(cè)
　　對(duì)篩選出的過量SaGRC、SaGRP、SaOAS擬南芥株系進(jìn)行基因表達(dá)定量分析，最終分別選取了2個(gè)株系進(jìn)行種子萌發(fā)、彎根實(shí)驗(yàn)，以及相關(guān)生理生化指標(biāo)的測(cè)定。結(jié)果顯示，在不同濃度的NaCl處理下，轉(zhuǎn)基因擬南芥的種子萌發(fā)情況優(yōu)于野生型擬南芥，轉(zhuǎn)基因株系的丙二醛（MDA）、脯氨酸（Pro）、還原型谷胱甘肽（GSH）含量等指標(biāo)顯示，轉(zhuǎn)基