靈芝HMG-CoA還原酶（HMGR）基因的克隆、功能驗證及表達(dá)調(diào)控的初步研究.pdf

1、靈芝[(Ganoderma lucidum(Leyss.ex.Fr.)Karst)]屬于真菌界(Mycota),擔(dān)子菌亞門(Basidiomycotina),層菌綱(Hymenomycetes),靈芝屬(Ganoderma),是我國著名的藥用真菌,已有2000多年的藥用歷史,具有重要的藥理作用。靈芝三萜(靈芝酸)是靈芝的主要藥效成分之一,具有抗癌、降血壓、降血脂、抗過敏抗HIV-1和抗HIV-1的蛋白酶及轉(zhuǎn)錄酶等功能。 在靈芝H

2、MGR基因的克隆方面,已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展：擴(kuò)增獲得了靈芝HMGR基因的基因組全長；以原基時cDNA為模板,擴(kuò)增獲得了三個cDNA片斷,進(jìn)而推測出cDNA全長序列；另外還通過SEFA-PCR擴(kuò)增獲得了靈芝HMGR基因的啟動子序列。 本試驗根據(jù)已經(jīng)獲得的靈芝HMGR基因cDNA特異片斷,設(shè)計兩條引物,用TaKaRa公司的3'-Full RACE Core Set Ver.2.0試劑盒擴(kuò)增得到了3'非翻譯區(qū)序列,再設(shè)計兩對引物PCR

3、擴(kuò)增原基時cDNA獲得cDNA全長序列,長3681bp,編碼產(chǎn)生1226個氨基酸。 通過對HMGR基因的結(jié)構(gòu)預(yù)測分析發(fā)現(xiàn),HMGR基因含有三個結(jié)構(gòu)域:N-端的疏水區(qū)(626 aa)、Linker(147 aa)和C-端的催化域(454 aa),并且在疏水區(qū)預(yù)測含有8個跨膜區(qū)。將預(yù)測的不含N-端疏水區(qū)但包含Linker和催化域的cDNA序列克隆到酵母表達(dá)載體pYF1845中,轉(zhuǎn)入一個缺乏HMGR活性、生長需要甲羥戊酸的酵母突變株J

4、RY1130。結(jié)果轉(zhuǎn)化子可以在不含甲羥戊酸的培養(yǎng)基平板上生長,證實了所獲得的HMGR基因cDNA序列的功能,而且表明N-端的疏水區(qū)對HMGR催化功能的實現(xiàn)不是必需的。 靈芝三萜是靈芝的次生代謝產(chǎn)物,其生物合成受到發(fā)育時期和誘導(dǎo)因子的調(diào)控。HMGR基因是三萜生物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因。RT-PCR檢測靈芝HMGR基因在菌絲不同發(fā)育時期mRNA水平的表達(dá)量。結(jié)果表明,當(dāng)靈芝菌絲生長到一定階段(14天)后,隨著培養(yǎng)時間的延長,HMGR

5、基因表達(dá)量明顯增加。 茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MJ)在細(xì)胞的多種逆境反應(yīng)中起信號介導(dǎo)作用,對多種次生代謝產(chǎn)物的合成具有誘導(dǎo)作用。我們分別研究了不同濃度和不同誘導(dǎo)時間的MJ對靈芝菌絲中三萜含量和HMGR基因表達(dá)量。當(dāng)MJ濃度為50 μM時,菌絲三萜含量最高,比陰性對照提高了25％,具有顯著性差異(P<0.01)。除了10 μM的MJ外,用其他濃度誘導(dǎo)時,HMGR基因的表達(dá)量均有增加了,在100 μM的MJ作用

6、下,HMGR的表達(dá)量最大,與陰性對照相比,提高了10倍。 茉莉酸甲酯的誘導(dǎo)時間與靈芝菌絲中三萜含量呈正相關(guān),即MJ對菌絲的誘導(dǎo)時間越長,菌絲中三萜含量越高。而HMGR基因的表達(dá)量變化規(guī)律與茉莉酸甲酯的誘導(dǎo)時間的長短并不一致,呈正態(tài)分布,其中以茉莉酸甲酯作用5天的菌絲中表達(dá)量最大,與最小值6天相比,提高了284倍。 紫外誘變處理靈芝原生質(zhì)體,經(jīng)過初篩(菌絲生長速率)、精篩(菌絲干重和三萜含量)和穩(wěn)定性試驗(傳代后菌絲三萜含

7、量),獲得了2株三萜含量穩(wěn)定且顯著(P＜0.01)提高的誘變株UV-3和UV-10。 測量2株三萜高產(chǎn)誘變株子實體中三萜含量篩選了誘變株UV-3,其在栽培袋中的菌絲生長速率及子實體中三萜含量分剔比出發(fā)菌株高了58.6％和29.4％。具有顯著差異(P＜0.01)。SRAP-PCR結(jié)果說明,誘變株UV-3與出發(fā)菌株相比,DNA指紋圖譜發(fā)生了明顯改變。 RT-PCR檢測HMGR基因在出發(fā)菌株和2株三萜穩(wěn)定高產(chǎn)誘變株中mRNA水