蠟梅脫氫抗壞血酸還原酶基因的克隆與功能初步分析.pdf

1、脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)是谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶超級家族中的一員，目前已經(jīng)從擬南芥、水稻、菠菜等植物中克隆得到，在蠟梅中的克隆還未見報道。DHAR在抗壞血酸的再生過程中具有重要的作用，它在谷胱甘肽的參與下將脫氫抗壞血酸還原為抗壞血酸，增加抗壞血酸在植物體內(nèi)的積累。DHAR在植物中的活性關(guān)系到植物抗性的高低，它在植物抵抗外源脅迫時具有重要的作用。另外DHAR在植物的生長中也具有重要的作用。
　　 本研究從蠟梅花中克隆得到了DHAR基

2、因，并命名為CpDHAR基因。通過生物信息學(xué)手段對該基因的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測；構(gòu)建了原核表達(dá)載體，并在大腸桿菌中表達(dá)了CpDHAR；對蠟梅花中的DHAR含量進(jìn)行了熒光定量分析，其具體研究結(jié)果如下：
　　 1、CpDHAR基因的克隆與結(jié)構(gòu)預(yù)測
　　 通過對蠟梅cDNA文庫隨機(jī)挑選克隆測序，獲得了大小為890bp的cDNA序列，序列分析表明，該基因的ORF框含有651bp，編碼蛋白含有216個氨基酸，理論分子量為24.02KD，

3、并在3'-UTR區(qū)中含有一個加尾信號序列(PloyA)AATAAA。經(jīng)生物信息學(xué)分析表明，該基因編碼的蛋白由占總蛋白44.44％的α螺旋旋、占總蛋白45.37％的隨機(jī)卷曲以及占總蛋白含量為10.19％的延伸鏈組成，并且具有豐富的疏水區(qū)和13個磷酸化位點。
　　 2、構(gòu)建載體PET-CpDHAR并進(jìn)行原核表達(dá)分析
　　 通過對載體和目的片段的特征分析，設(shè)計了帶SacⅠ和HindⅢ酶切位點的引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，利用中間載體

4、PMD19-T，將目的片段連接到PET-32a上。經(jīng)測序和酶切雙重驗證正確后，將重組載體PET-CpDHAR轉(zhuǎn)入BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá)。經(jīng)SDS-PAG驗證，結(jié)果表明，在28℃、1mMIPTG、過夜誘導(dǎo)條件下，該重組蛋白在表達(dá)菌株BL21(DE3)中得到了大量的表達(dá)。
　　 3、CpDHAR在蠟梅花中不同組織和不同時期的熒光定量分析
　　 在蠟梅開花時期，以不同開花時期和盛開期不同蠟梅花組織為材料進(jìn)行熒光定量分析，