藥物中痕量大分子蛋白檢測(cè)方法的研究與應(yīng)用.pdf

1、過(guò)敏反應(yīng)在臨床上經(jīng)常發(fā)生，嚴(yán)重時(shí)可致人死亡，尤以中藥注射液、注射用藥用輔料、β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素等藥物最為突出，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，這些藥物中殘留的大分子蛋白可引起過(guò)敏反應(yīng)，故為了保證用藥安全，去除這些雜質(zhì)是非常重要的，藥品生產(chǎn)者也通過(guò)不斷的技術(shù)改進(jìn)盡量去除這些大分子蛋白雜質(zhì)，因此需要建立一個(gè)靈敏度高、選擇性好的方法對(duì)生產(chǎn)工藝進(jìn)行驗(yàn)證和監(jiān)測(cè)。然而由于這些藥物生產(chǎn)過(guò)程復(fù)雜，大分子蛋白在生產(chǎn)過(guò)程中可能發(fā)生一系列的聚合、裂解等反應(yīng)，故不適合用基于抗體-

2、抗原反應(yīng)的檢測(cè)特異性活性蛋白的免疫法對(duì)其進(jìn)行測(cè)定，也不適合使用基質(zhì)影響大、靈敏度低的傳統(tǒng)的光譜法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，故建立一個(gè)準(zhǔn)確度高、特異性好、靈敏度高的蛋白檢測(cè)方法是藥物分析者面臨的一個(gè)難題。
　　中藥注射液中的植物蛋白等大分子雜質(zhì)易隨提取過(guò)程殘留到終產(chǎn)品中，本文以茵梔黃注射液為研究對(duì)象，針對(duì)中藥注射液成分復(fù)雜但大多是小分子這一特性，利用根據(jù)分子量大小對(duì)化合物進(jìn)行分離的高效凝膠排阻色譜法（HPSEC）分析技術(shù)對(duì)其中的大分子蛋白含量進(jìn)

3、行了研究，為了進(jìn)一步提高靈敏度，優(yōu)選了檢測(cè)波長(zhǎng)，選取蛋白吸收更高的末端吸收作為檢測(cè)波長(zhǎng)。色譜柱為 TSK gel SuperSW2000色譜柱（4μm,4.6×300 mm），流動(dòng)相為磷酸鹽緩沖溶液，流速為0.3 mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm，樣品溶液經(jīng)過(guò)濾后可直接進(jìn)樣，結(jié)果該方法在0.312-40.0μg/mL線性范圍內(nèi)關(guān)系良好（R2=0.999），回收率均大于81％，重復(fù)性良好，RSD為0.6%，檢測(cè)限可以達(dá)到0.104

4、μg/mL，靈敏度比常用的測(cè)定蛋白的靈敏度最高的方法考馬斯亮藍(lán)法（Bradford）還提高了10倍左右，且只對(duì)樣品進(jìn)行簡(jiǎn)單處理即可進(jìn)行分析，結(jié)果表明，該方法操作簡(jiǎn)便快速，重現(xiàn)性好，為其他同類(lèi)藥物中的大分子雜質(zhì)的檢測(cè)提供了一種可借鑒的分析手段。
　　注射用乳糖是注射用藥物生產(chǎn)中一種很好的藥用輔料，但是由于乳糖來(lái)源于動(dòng)物乳清，可能會(huì)殘留有微量乳清蛋白引起過(guò)敏反應(yīng)，故需要對(duì)其中的乳清蛋白進(jìn)行嚴(yán)格控制。本研究同時(shí)建立了 HPSEC法和超高

5、效液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF）兩種方法對(duì)乳糖中的α-乳白蛋白及β-乳球蛋白進(jìn)行檢測(cè)，HPSEC法使用的色譜柱為 TSK gel SuperSW2000色譜柱（4μm,4.6×300 mm），流動(dòng)相為磷酸鹽緩沖溶液，流速為0.3 mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm，結(jié)果該方法在α-乳白蛋白和β-乳球蛋白總濃度3.40~68.0μg/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回收率均大于87%，重復(fù)性良好，RSD為0.5%

6、，檢測(cè)限為1.13μg/mL，結(jié)果表明本研究建立的HPSEC法靈敏度較 UPLC-Q-TOF法稍高，且該方法操作簡(jiǎn)單快速，成本相對(duì)較低，適用性更廣，易于普及，但由于α-乳白蛋白和β-乳球蛋白分子量接近，在 HPSEC色譜柱中不能完全分離，故不能分別對(duì)二者進(jìn)行定量，只能測(cè)定二者含量總和。UPLC-Q-TOF法以0.1%三氟乙酸（TFA）水溶液和0.1%TFA乙腈溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，經(jīng)蛋白柱分離后，采用飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)器（TOF）進(jìn)行

7、全離子掃描模式檢測(cè)。應(yīng)用 Peakview1.2分析軟件，通過(guò)對(duì)化合物離子精確質(zhì)荷比、特征二級(jí)質(zhì)譜以及保留時(shí)間的比對(duì)，對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行驗(yàn)證。α-乳白蛋白和β-乳球蛋白測(cè)定的線性范圍分別在2.00~80.0μg/mL和6.00~240.0μg/mL之間，相關(guān)系數(shù)為0.997和0.996;檢測(cè)限分別為1.00μg/mL和3.00μg/mL;加樣回收率分別為82.9%~87.2%和96.1%~98.4%。結(jié)果表明，本方法特異性好，結(jié)果準(zhǔn)確，但對(duì)蛋

8、白直接測(cè)定靈敏度并不高。故在實(shí)際檢測(cè)中，若需要操作簡(jiǎn)單快速，成本較低，靈敏度高且需對(duì)兩種蛋白總和進(jìn)行檢測(cè)時(shí)可選用HPSEC法；若需要對(duì)蛋白特異性要求較高，對(duì)蛋白分別進(jìn)行鑒定和檢測(cè)且靈敏度要求不高時(shí)可采用 UPLC-Q-TOF；若需要對(duì)蛋白特異性要求較高且靈敏度要求也較高時(shí)，可對(duì) UPLC-Q-TOF法前處理進(jìn)一步研究，使大分子裂解成分子量較小的化合物再進(jìn)行檢測(cè)。
　　青霉素類(lèi)等β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素因其發(fā)酵工藝，易產(chǎn)生并殘留大分子蛋白

9、，本研究以青霉素 V鉀為模型藥物，建立了一個(gè)中空纖維離心超濾（HFCF-UF）裝置對(duì)蛋白大分子進(jìn)行分離和富集，然后經(jīng)末端吸收的HPSEC法對(duì)大分子進(jìn)行分析測(cè)定。色譜柱為T(mén)SK gel SuperSW2000色譜柱（4μm,4.6×300 mm），流動(dòng)相為磷酸鹽緩沖溶液，流速為0.3 mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm，樣品溶液經(jīng) HFCF-UF一步離心富集可直接進(jìn)樣，并對(duì)非特異性吸附（NSB）現(xiàn)象進(jìn)行了考察。結(jié)果該方法富集倍數(shù)高達(dá)