增厚結(jié)節(jié)型鮮紅斑痣的超微結(jié)構(gòu)、體細(xì)胞突變及分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：鮮紅斑痣（Port wine stain，PWS）是一種發(fā)生在人皮膚真皮淺層先天性進(jìn)行性發(fā)展的血管畸形，新生兒的發(fā)生率約為3-5‰，且85％的患者皮損發(fā)生于面部，常持續(xù)終生不退，給患者社會(huì)心理的成長(zhǎng)帶來極大的負(fù)面影響，是個(gè)急需解決的重要的臨床問題。許多PWS患者在成年后皮損逐漸增厚并可能發(fā)展為增生結(jié)節(jié)型損害，成為臨床治療的難題，其發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)理尚不清楚。本課題將從以下幾個(gè)方面探索增厚結(jié)節(jié)型PWS的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和形成機(jī)理：明確增厚結(jié)

2、節(jié)型PWS不同細(xì)胞成分的超微結(jié)構(gòu)病理特征；研究增厚結(jié)節(jié)型PWS中異常激活的相關(guān)激酶信號(hào)通路；篩查PWS結(jié)節(jié)型皮損中特異性的體細(xì)胞突變，為揭示其發(fā)生機(jī)制、探索更為有效的治療方案提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1、納入16例PWS患者，收集其不同類型的皮損，6例患者取紅斑型和結(jié)節(jié)型皮損各1份，5例患者僅取結(jié)節(jié)1份，5例患者僅取紅斑組織1份，共收集結(jié)節(jié)紅斑組織各11份；其中另收集7例面部正常皮膚為對(duì)照。將組織樣本切割為<0.5mm

3、3的組織塊，采用Karnovsky溶液（1%戊二醛和4%多聚甲醛溶于0.1M的磷酸鹽緩沖液中）固定24小時(shí)，用1%四氧化鋨后固定，所有樣本逐級(jí)脫水、滲透、樹脂包埋，用Leica Ultracut7切片機(jī)制作厚度約為50nm的超薄切片并染色，用透射電鏡（Tecnai G2 Spirit, FEI, Hillsboro, Oregon）設(shè)置電壓為80kV進(jìn)行觀察拍照。
　　2、收集來自13例PWS病人的21份組織樣本，包括8份增厚組織

4、，8份結(jié)節(jié)組織以及PWS病人皮損周邊正常組織5份（距離PWS皮損區(qū)約0.5-1cm），另收集兩例正常人皮膚組織作為對(duì)照。皮膚組織樣本在福爾馬林溶液中過夜固定，經(jīng)過脫水清洗后嵌入石蠟中并做成5mm厚石蠟包塊，組織切片用HE染色，并且用光學(xué)顯微鏡采圖。組織切片行免疫組化檢測(cè)，凍存或新鮮組織提取蛋白行Western Blot檢測(cè)，研究PKCα、PI3K、 PDPK1、 PLC-γ、PP2A、DAG等蛋白在PWS紅斑及結(jié)節(jié)組織中的表達(dá)情況。

5、r>　　3、收集4例PWS患者的皮膚組織樣本，每例患者均分別獲得紅斑、結(jié)節(jié)及臨近的正常皮膚組織。從新鮮及凍存組織中提取組織DNA，構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)，經(jīng)Agilent2100 bioanalyzer（Agilent DNA1000 Reagents）確定插入片段大小為100-250bp，使用Agilent SureSelect Human All Exon V5（50M）捕獲平臺(tái)進(jìn)行外顯子組捕獲，洗脫富集的片段后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測(cè)序采用His

6、eq4000測(cè)序平臺(tái)行全外顯子測(cè)序。采用SAMtools（http://samtools.sourceforge.net/mpileup.shtml）進(jìn)行基因變異檢測(cè)分析。
　　結(jié)果：
　　1、PWS組織中存在代謝極度活躍的內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞、成纖維細(xì)胞，這些細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)都存在大量的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、游離核糖體、高爾基復(fù)合體、增大的線粒體及大量囊泡。在真皮乳頭和PWS血管周圍可見過度增生肥大的膠原纖維束。在基底層的角質(zhì)形成細(xì)胞中可以見

7、到聚集的黑素小體及近核膜區(qū)粗大的張力纖維?；啄ё儽?、破壞、半橋粒減少，呈現(xiàn)退行性病變特征。
　　2、在PWS組織中檢測(cè)PKCα、PI3K、PDPK1、PLC-γ的磷酸化水平及PP2A和DAG的蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在增厚的紅斑組織較周邊正常組織表達(dá)水平均有所增加；在結(jié)節(jié)組織中這些分子廣泛表達(dá)于血管基質(zhì)中；許多增生的細(xì)胞如成纖維細(xì)胞等，這些分子也表現(xiàn)出明顯的活化及上調(diào)；Western Blot結(jié)果與免疫組化結(jié)果一致。上述結(jié)果表明，PKC

8、α、PI3K、PDPK1和PLC-γ的異常激活及PP2A和DAG的上調(diào)不僅僅存在于增厚型PWS組織的內(nèi)皮細(xì)胞中，也可見于結(jié)節(jié)型組織的血管及周圍的成纖維細(xì)胞。
　　3、外顯子測(cè)序發(fā)現(xiàn)在PWS增厚和結(jié)節(jié)皮損中存在Trim69（c.825C>T/p.T161M）、Muc6（p.Thr1807Ser/c.5420C>G）、Muc3a（c.1951A>T/p.Ser651Cys;c.1952G>C/p.Ser651 Thr；c.1973 C

9、>T/p.Ser658 Leu；c.2014T>C/p.Phe672Leu）等基因的錯(cuò)義突變。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)僅出現(xiàn)在結(jié)節(jié)樣本中的特異突變有Igfn1（c.5907A>G/p.I2008M）錯(cuò)義突變，Mapk7（T>C，Chr17:19285524）及Znf528（T>C，Chr19:42729848）基因的同義突變。
　　結(jié)論：
　　1、在PWS病理進(jìn)行性發(fā)展中存在著代謝與增生活躍的內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞、成纖維細(xì)胞，直接導(dǎo)致血管及細(xì)

10、胞外基質(zhì)的增殖，從而導(dǎo)致軟組織增生和結(jié)節(jié)形成。
　　2、PI3K和PKCa信號(hào)通路的異常激活在鮮紅斑痣皮損發(fā)展成為增厚及結(jié)節(jié)的過程中可能發(fā)揮重要作用。
　　3、體細(xì)胞基因突變與 PWS皮損的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Trim69（c.825C>T/p.T161M）、Muc6（p.Thr1807Ser/c.5420C>G）、Muc3a（c.1951A>T/p.Ser651Cys;c.1952G>C/p.Ser651 Thr；c.197