FNDC5-Irisin改善肝臟糖脂代謝紊亂的作用及分子機制.pdf

1、2012年發(fā)現(xiàn)的irisin是一種新型肌肉因子，可以通過刺激解耦聯(lián)蛋白-1(uncoupling protein-Ⅰ，UCP1)的表達促進白色脂肪細胞轉(zhuǎn)換成棕色脂肪細胞。Ⅲ型纖連蛋白組件包含蛋白5（typeⅢ domain-containing protein5，F(xiàn)NDC5）是由兩個纖連蛋白結(jié)構(gòu)域、一個信號肽和一個嵌入細胞膜的疏水結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的跨膜蛋白，F(xiàn)NDC5在細胞膜上發(fā)生水解生成irisin。小鼠FNDC5過表達可改善肥胖小鼠胰島素

2、抵抗和糖耐量異常。肥胖人群血清irisin濃度與肝臟甘油三酯(triacylglycerol，TG)含量負相關(guān)。本論文分為兩個部分，分別探討了(1)irisin在2型糖尿病模型小鼠肝臟糖異生和糖原合成中的作用與機制;(2) FNDC5在小鼠肝臟脂肪酸氧化、自噬、脂肪從頭合成及脂肪變性中的作用。
　　一、 Irisin減輕糖尿病模型肝臟糖異生、促進糖原合成的作用與分子機制
　　1.背景：
　　高血糖和胰島素抵抗是2型糖尿

3、病典型特征。肝臟參與葡萄糖的代謝過程，是調(diào)節(jié)血糖的主要器官，在葡萄糖的貯存、分布和調(diào)節(jié)上具有重要意義。當血糖濃度升高時，肝臟通過糖原合成將血糖轉(zhuǎn)變成糖原貯存于肝臟，并通過將過剩的葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)橹竞图铀倭姿嵛焯茄h(huán)等途徑，維持血糖濃度相對穩(wěn)定。相反，當葡萄糖供應(yīng)不足、肝糖原儲備減少時，肝臟可將乳糖、甘油及生糖氨基酸等通過糖異生作用轉(zhuǎn)化為葡萄糖（劇烈運動和饑餓時尤為顯著）。2型糖尿病時由于胰島素抵抗和肝臟對血糖調(diào)控失衡，通常表現(xiàn)出糖異生異常

4、增強，而肝臟糖原合成減弱。肝臟對糖異生和糖原合成調(diào)控的失衡進一步加重2型糖尿病血糖紊亂和胰島素抵抗，形成惡性循環(huán)，因此逆轉(zhuǎn)或抑制肝臟糖異生過度激活，增加肝糖原合成是防治2型糖尿病的重要策略之一。Irisin在2型糖尿病肝臟糖異生和糖原合成中是否發(fā)揮作用尚不明確，本研究主要探討irisin對肝糖異生和糖原合成的作用及卜游信號通路。
　　2.目的
　　本研究擬探討irisin在胰島素抵抗肝細胞和2型糖尿病模型小鼠肝臟糖異生和糖原

5、合成中的作用及分子機制，并探討小鼠皮下給予irisin對葡萄糖代謝紊亂和胰島素抵抗的治療作用。
　　3.方法
　　人肝癌細胞系（HepG2）培養(yǎng)在含25mM葡萄糖、10％ FBS和1％雙抗(100units/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)基中并保持37℃、5％的CO2和飽和濕度。小鼠原代肝細胞培養(yǎng)在含10％生長因子，10％ FBS和1％雙抗的專用原代肝細胞培養(yǎng)基中。
　　動物實驗采用C57BL/6J

6、小鼠，6周齡雄性C57BL/6J小鼠適應(yīng)環(huán)境l周后，將其隨機分為三組，各7只，Ctrl組腹腔注射10mmol/l檸檬酸鹽緩沖液并給予正常飲食（14.7 kJ/g，13％脂肪含量）。另外兩組小鼠都接受單次小劑量腹腔注射鏈脲霉素(streptozocin，STZ)合并高脂飲食以誘導(dǎo)2型糖尿病模型，3周后，給予這兩組小鼠高脂飲食（21.8 kJ/g，60％脂肪含量），8周后將這兩組糖尿病成模小鼠皮下微量滲透泵的形式分別給予生理鹽水或irisi

7、n，期間小鼠維持高脂飲食狀態(tài)，2周后三組小鼠進行取材和急性實驗。
　　采用酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)測定irisin和胰島素水平。用葡萄糖脫氫酶偶聯(lián)反應(yīng)和乳酸脫氫酶偶聯(lián)反應(yīng)分別測定葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase，G6Pase)和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK

8、)活性。蛋白質(zhì)免疫分析技術(shù)(Western blotting)檢測蛋白PEPCK，G6pase，糖原合成酶(glycogen synthase，GS)，磷酸化GS，糖原合成酶激酶-3（glycogen synthase kinase-3，GSK3），磷酸化GSK3，蛋白激酶B(Protein kinaseA，Akt)，磷酸化Akt，磷脂酰肌醇-3激酶100α(Phosphoinositide3-kinase100α，PI3K100α)和

9、PI3K100β，叉頭轉(zhuǎn)錄因子l(Forkhead box O1，F(xiàn)OXO1)，磷酸化FOXO1和磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)表達。
　　用real-time PCR(RT-PCR)法檢測PEPCK、G6pase mRNA水平。采用過碘酸希夫染色(Periodic Acid-Schiff stain，PAS)染色法檢測小鼠肝臟糖原含量;葡萄糖耐量(Gl

10、ucose tolerance test，GTT)和胰島素耐量(Insulin tolerance test，ITT)實驗檢測小鼠葡萄糖代謝和胰島素抵抗情況;用葡萄糖氧化還原試劑盒和糖原檢測試劑盒分別檢測單位時間內(nèi)肝細胞產(chǎn)糖量和糖原生成含量。
　　4.結(jié)果
　　(1) Irisin減少葡萄糖胺(Glucosamine，G;cN)和棕櫚酸(palmitate)對HepG2細胞PEPCK、G6Pase mRNA和蛋白表達以及單位

11、時間產(chǎn)糖量的促進作用。
　　(2) Irisin通過促進GSK3蛋白磷酸化，抑制GS蛋白磷酸化，增加GlcN和棕櫚酸誘導(dǎo)肝細胞肝糖原合成作用，增加肝糖原貯存量。
　　(3) GlcN預(yù)處理HepG2細胞顯著減少PI3K P100α和PI3K P100β蛋白的表達，irisin刺激HepG2細胞24h可升高PI3K P100α蛋白表達，對PI3K P100β蛋白表達無明顯作用。Irisin通過增強PI3K/Akt信號通路抑制F

12、OXO1活性。Irisin與胰島素均可增加肝細胞Akt和FOXO1磷酸化，表明irisin和胰島素均可激活PI3K/Akt信號通路。
　　(4) Irisin對糖異生作用的抑制效應(yīng)可被PI3K抑制劑LY294002或Akt抑制劑MK2206所阻斷;Irisin通過促進GSK3蛋白磷酸化，抑制GS蛋白磷酸化從而增強胰島素抵抗HepG2細胞糖原合成作用，增加肝糖原貯存，該效應(yīng)可被PI3K抑制劑或Akt抑制劑所阻斷。
　　(5)鏈

13、脲霉素(streptozocin，STZ)/高脂飲食（High fat diets，HFD）誘導(dǎo)2型糖尿病小鼠血清和肝臟irisin水平均低于對照組小鼠，皮下微量滲透泵給予irisin（STZ/HFD-irisin組）明顯增高血清和肝臟irisin水平，但對小鼠的體重、飲食量和尾動脈收縮壓并無作用。
　　(6)S TZ/HFD小鼠空腹血糖水平明顯高于Ctrl組小鼠，血清胰島素水平無差異，微量滲透泵給予irisin可降低STZ/HF

14、D小鼠空腹血糖，改善葡萄糖耐量和胰島素抵抗，增加肝臟糖原合成與貯存，而對血清胰島素水平無影響。
　　(7)皮下給予irisin通過PI3K/Akt信號通路下調(diào)小鼠肝臟PEPCK和G6Pase蛋白和mRNA表達;增強GSK3磷酸化，減弱GS磷酸化，從而改善STZ/HFD誘導(dǎo)的2型糖尿病小鼠肝臟糖異生過度增強和肝臟糖原合成減少。
　　5.結(jié)論
　　Irisin通過PI3K/Akt/FOXOl信號通路下調(diào)PEPCK和G6Pa

15、se活性，抑制糖異生作用;通過PI3K/Akt/GSK3信號通路增強GS活性，促進糖原合成。長期皮下給予irisin可以改善2型糖尿病小鼠高血糖癥和胰島素抵抗。
　　二、 FNDC5促進小鼠肝臟自噬和脂肪酸氧化、減輕脂肪從頭合成的作用與分子機制
　　1.背景
　　非酒精性脂肪肝(Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)以肝細胞中甘油三酯(triacylglycerol，TG)過度增

16、加為其主要特征。脂肪酸氧化(fatty acid oxidation，F(xiàn)AO)是在供氧充足的情況下發(fā)生在線粒體的氧化反應(yīng)，脂肪酸經(jīng)活化生成乙酰輔酶A(acetyl-CoA)，acetyl-CoA轉(zhuǎn)移至線粒體，在線粒體中生成酮體或進行B氧化，最終經(jīng)三羧酸循環(huán)徹底被氧化成二氧化碳和水，并釋放出大量能量供機體利用。自噬是溶酶體介導(dǎo)的一種細胞死亡方式，是具有高度保守性的自我保護機制。自噬以囊泡的形式吞噬受損和需降解的自身細胞質(zhì)蛋白或細胞器，形成

17、自噬小體，自噬小體與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內(nèi)容物，以此實現(xiàn)細胞和細胞器的代謝和更新。FAO和自噬功能減弱以及脂肪從頭合成(de novo lipogenesis)加強是肝臟脂質(zhì)過度沉積的重要影響因素。因此尋找調(diào)控FAO、自噬或脂肪從頭合成的靶分子成為治療肝臟脂肪變性的重要策略之一。Ⅲ型纖連蛋白組件包含蛋白5(FibronectintypeⅢ domain-containing protein5，F(xiàn)NDC5)是由一個信號

18、肽、兩個纖連蛋白結(jié)構(gòu)域和一個嵌入細胞膜的疏水結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的Ⅰ型膜蛋白。尾靜脈注射FNDC5全長腺病毒可減輕飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠體重。有氧運動可使骨骼肌中FNDC5表達增多，F(xiàn)NDC5在細胞膜發(fā)生水解生成irisin，irisin進入循環(huán)并通過血液到達脂肪組織，具有促使皮下白色脂肪組織發(fā)生棕色變性的作用，并參與調(diào)節(jié)有氧運動介導(dǎo)的各種代謝改變。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)慢病毒過表達FNDC5可顯著增強高脂飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠能量消耗，減輕高糖血癥和胰島素抵

19、抗，并可促進脂肪組織脂解。然而FNDC5是否參與肝臟脂肪變性、自噬以及脂肪酸氧化(fatty acid oxidation，F(xiàn)AO)的調(diào)控仍然未知。
　　2.目的
　　本研究擬探討FNDC5在脂肪酸氧化、自噬、脂肪從頭合成以及肝臟脂肪變性中的作用及分子機制，并探討尾靜脈注射FNDC5過表達腺病毒對肝臟脂肪變性的作用。
　　3.方法
　　使用4-8周齡雄性C57/BL6J(WT)小鼠和以C57/BL6J小鼠為背景的

20、FNDC5敲基因(FNDC5-/-)小鼠。膠原酶消化法分離WT和FNDC5-/-小鼠原代肝實質(zhì)細胞。4周齡WT和FNDC5-/-小鼠喂養(yǎng)12周高脂飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠模型。酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，Western blot和RT-PCR確認FNDC5基因敲除有效性。采用酶法測定血清和細胞組織中甘油三酯(triacylglycerol，TG)、總膽固醇(total c

21、holesterol，CHO)、游離脂肪酸(non-esterified fatty acid，NEFA)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(glutamic-oxalacetic transaminase，AST)濃度。RT-PCR檢測FAO、自噬和脂肪從頭合成基因(Hmgcs2，Cpt1，Acoxl，Ehhadh，Acsll，Peci，Cyp4al0，Cyp4a12; UNC51-

22、1ike kinase l(Ulk1)，Ulk2，Atg5，Atg8，Atg10; Srebplc,Dgatl，F(xiàn)asn，Scd1)表達水平。Western Blot和免疫組化法檢測AMPK/mTORC1(AMPK、S6、raptor)及自噬相關(guān)蛋白(p62，LC3B，ULK1)表達水平。油紅O染色法檢測肝臟組織和細胞脂肪沉積。采用14C放射性元素標記法測定FAO速率。mRFP-GFP-LC3B自噬雙標腺病毒轉(zhuǎn)染，觀察自噬流發(fā)生。

23、>　　4.結(jié)果
　　(1)與同齡WT小鼠相比，8周齡FNDC5-/-小鼠基礎(chǔ)狀態(tài)下肝臟出現(xiàn)輕度脂肪沉積，禁食后肝臟出現(xiàn)嚴重脂肪沉積。禁食后FNDC5-/-小鼠血清NEF八、TG以及NEFA水平顯著高于WT小鼠。
　　(2) FNDC5-/-小鼠基礎(chǔ)狀態(tài)與禁食后肝臟FAO相關(guān)基因表達均低于WT小鼠，AMPK激動劑(AICAR)和PPARat激動劑(WY14643)增加FNDC5-/-小鼠FAO基因的表達，減少肝臟脂質(zhì)沉積;AM

24、PK siRNA加重WT和FNDC5-/-小鼠肝臟及肝細胞脂質(zhì)沉積，表明AMPK/PPARα介導(dǎo)FNDC5對自噬的調(diào)控作用。
　　(3) mTORC1抑制劑雷帕霉素(rapamycin)可增加FNDC5-/-小鼠肝臟FAO基因表達，減少FNDC5-/-小鼠肝臟脂肪從頭合成基因表達和小鼠肝臟TG含量。
　　(4)饑餓或氨基酸剝奪處理明顯減少WT小鼠肝臟和肝細胞自噬蛋白p62表達，增加LC3B蛋白表達以及自噬流的發(fā)生，而營養(yǎng)剝奪

25、刺激對FNDC5-/-小鼠白噬作用影響不大。氨基酸剝奪處理或二甲雙胍(metform in)可時間依賴性增加WT小鼠肝細胞AMPK、ULK1和raptor磷酸化，但對FNDC5-/-小鼠作用較弱。AMPK激動劑AICAR可增加WT和FNDC5-/-小鼠肝細胞自噬作用，AMPK siRNA減少WT和FNDC5-/-小鼠肝細胞自噬發(fā)生。
　　(5)雷帕霉素處理可降下調(diào)FNDC5-/-小鼠肝臟和肝細胞中p62蛋白表達，上調(diào)LC3B蛋白表

26、達。雷帕霉素處理顯著增加WT和FNDC5-/-小鼠肝細胞自噬流發(fā)生，減少血清肝臟損傷指標(AST，ALT)水平。雷帕霉素對棕櫚酸誘導(dǎo)的小鼠肝細胞脂質(zhì)沉積的改善作用依賴于自噬基因Atg5。
　　(6) FNDC5-/-/HFD小鼠肝臟質(zhì)量和肝臟質(zhì)量/體重比率高于WT/HFD小鼠，而兩組小鼠體重和飲食量無差異。FNDC5基因缺失加重HFD誘導(dǎo)引起的肝臟脂質(zhì)沉積、血清AST、ALT水平上調(diào)、FAO基因表達下調(diào)和脂肪從頭合成基岡表達上調(diào)。

27、
　　(7)外源性FNDC5時間和劑量依賴性增加小鼠肝細胞FAO基因表達，且在100nmol/L和24h作用達到峰值。外源性FNDC5通過AMPK/mTORC1信號通路減少FNDC5-/-小鼠肝細胞TG含量、促進自噬發(fā)生并改善棕櫚酸誘導(dǎo)的脂肪沉積。
　　(8)尾靜脈注射FNDC5過表達腺病毒通過AMPK/ mTORC1信號通路有效增強HFD誘導(dǎo)肥胖小鼠減弱的FAO和自噬，改善肥胖小鼠肝臟脂質(zhì)沉積。
　　5.結(jié)論