FoxO蛋白在應(yīng)激致脂代謝紊亂中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、隨著社會(huì)逐漸進(jìn)步，人們的生活節(jié)奏不斷加快，機(jī)體所承受的生理和心理性應(yīng)激復(fù)雜和強(qiáng)烈程度不斷增加。長(zhǎng)期慢性應(yīng)激可以打亂機(jī)體內(nèi)環(huán)境，在許多疾病的發(fā)生過(guò)程中起重要作用。目前，慢性應(yīng)激被認(rèn)為是人類(lèi)許多重大疾病的重要病因和誘因之一，約75％～90％的疾病發(fā)生與應(yīng)激機(jī)制的激活有關(guān)。長(zhǎng)期以來(lái)，代謝紊亂和代謝性疾病的發(fā)生歸結(jié)于器官功能的失代償和神經(jīng)內(nèi)分泌的共同結(jié)果，但近年來(lái)的研究表明，它們的發(fā)生發(fā)展與應(yīng)激機(jī)制有著密切關(guān)系。但應(yīng)激在脂代謝性疾病如非酒精性脂

2、肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)的作用及具體機(jī)制尚不是非常明確。叉頭蛋白O(Fork head box O，F(xiàn)oxO)家族在介導(dǎo)胰島素和胰島素樣生長(zhǎng)因子通路參與細(xì)胞分化，凋亡和機(jī)體能量代謝中有至關(guān)重要的作用。通常認(rèn)為，F(xiàn)oxO蛋白作為胰島素代謝通路上的重要分子，對(duì)調(diào)控機(jī)體血糖的平衡有重要作用。近年來(lái)，許多研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxO蛋白不僅在糖代謝中起作用，同時(shí)也參與了脂質(zhì)代謝的調(diào)控，可能是

3、聯(lián)系2型糖尿病和脂代謝紊亂的關(guān)鍵分子，但關(guān)于在應(yīng)激致脂代謝紊亂過(guò)程中FoxO蛋白的變化及作用仍未見(jiàn)研究報(bào)導(dǎo)。
　　目的：
　　研究應(yīng)激在脂代謝紊亂如NAFLD發(fā)生發(fā)展中的作用并進(jìn)一步探究肝臟中FoxO蛋白在應(yīng)激致肝臟脂質(zhì)代謝紊亂中的調(diào)控作用。
　　方法：
　　用足底電刺激和束縛應(yīng)激構(gòu)建小鼠慢性應(yīng)激模型，通過(guò)檢測(cè)小鼠肝臟內(nèi)的甘油三酯含量和病理切片(HE染色和油紅O染色)來(lái)評(píng)定小鼠是否發(fā)生NAFLD;利用高通量檢測(cè)技

4、術(shù)對(duì)小鼠腹內(nèi)脂肪組織、血清及肝臟炎性因子進(jìn)行檢測(cè);用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time PCR, RT-PCR)和蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)方法檢測(cè)肝臟脂質(zhì)代謝相關(guān)基因，肝臟內(nèi)FoxO蛋白含量及上游通路變化;用FoxO6肝臟內(nèi)特異性高表達(dá)C57/b16小鼠及尾靜脈注射FoxO6腺病毒使之在體內(nèi)高表達(dá)Foxo6的C57/b16小鼠觀察血清膽固醇含量變化;利用RT-PCR技術(shù)篩選膽固醇代謝相關(guān)基因表達(dá)量情況;用FoxO6

5、腺病毒轉(zhuǎn)染小鼠肝原代細(xì)胞，觀察FoxO6對(duì)LDLR基因的調(diào)控作用，并用熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)及染色質(zhì)免疫沉淀(Chromatin Immunoprecipitation，Chip)來(lái)進(jìn)一步探究其調(diào)控方式。
　　結(jié)果：
　　1.慢性應(yīng)激可導(dǎo)致小鼠攝食量及體重增加量減少。應(yīng)激后12周內(nèi)，小鼠攝食量和體重?zé)o明顯增加，而對(duì)照組則穩(wěn)定增加。應(yīng)激12周后，應(yīng)激組小鼠體重及攝食量較對(duì)照組顯著減少。
　　2.慢性應(yīng)激組小鼠腹部脂肪含量較對(duì)照

6、組顯著降低，HE染色結(jié)果顯示，應(yīng)激組脂肪細(xì)胞較對(duì)照組顯著減小，血清中游離脂肪酸顯著高于對(duì)照組。慢性應(yīng)激小鼠脂肪IL-6和IL-1β較對(duì)照組顯著增高，而TNF-α和IL-18無(wú)明顯變化，使炎癥細(xì)胞聚集的趨化因子MIP-2、MCP-1和PAI-1血清含量也同樣顯著升高。
　　3.慢性應(yīng)激小鼠的肝指數(shù)(HI，肝臟重量/體重×100)升高。血清中的TC和TG均有升高趨勢(shì)但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而肝臟中TG、TC含量顯著升高。肝臟HE染色顯示，慢性

7、應(yīng)激組有明顯的脂滴沉積，肝細(xì)胞胞質(zhì)疏松，呈氣球樣變，炎性灶增加。慢性應(yīng)激組肝臟油紅O染色切片有大量微泡性脂滴沉積。
　　4.慢性應(yīng)激小鼠的血清ALT和AST水平顯著升高，并且NAFLD活動(dòng)性炎性評(píng)分也高于對(duì)照組。ELISA結(jié)果顯示，IL-6和TNF-α在血清中和肝臟中含量均升高;IL-Iβ和MCP-1血清含量升高，肝臟含量不變;IL-18均無(wú)明顯變化。
　　5.慢性應(yīng)激小鼠肝臟內(nèi)與TG合成相關(guān)基因Fasn、SCD1表達(dá)量顯著

8、升高，而其他基因如ACC1、ELOVL6、MTTP、ApoB等均無(wú)明顯變化。
　　6.12周慢性應(yīng)激小鼠的FoxO1 mRNA和蛋白在肝臟中的表達(dá)量均較對(duì)照組小鼠顯著增加;FoxO1在小鼠肝臟細(xì)胞核內(nèi)蛋白量較對(duì)照組增加;肝臟內(nèi)胰島素受體2(IRS2)mRNA表達(dá)量顯著降低，同時(shí)其下游的p-Akt/Akt相對(duì)減少。
　　7.肝臟內(nèi)特異性高表達(dá)FoxO6轉(zhuǎn)基因小鼠(FoxO6-tg)同對(duì)照組野生型小鼠對(duì)比，肝臟內(nèi)FoxO6基因表

9、達(dá)水平升高了三倍，F(xiàn)oxO6蛋白表達(dá)量升高了兩倍。FoxO6-tg小鼠體重與野生型小鼠相比，無(wú)明顯變化，但血清中膽固醇水平顯著升高，呈現(xiàn)出高膽固醇血癥狀態(tài)。
　　8.FoxO6轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟內(nèi)LDL受體(LDLR)的表達(dá)量較野生型小鼠了約50％-60％，蛋白表達(dá)水平同mRNA表達(dá)趨勢(shì)一致，較野生型小鼠顯著降低。野生型小鼠尾靜脈注射FoxO6病毒后檢測(cè)其肝臟LDLR基因及蛋白表達(dá)量變化，結(jié)果與FoxO6轉(zhuǎn)基因小鼠一致。FoxO6病毒

10、轉(zhuǎn)染入肝原代細(xì)胞，觀察LDLR表達(dá)量的變化。結(jié)果顯示，F(xiàn)oxO6病毒轉(zhuǎn)染組較空白病毒轉(zhuǎn)染組LDLR的基因及蛋白表達(dá)量均明顯降低。LDLR的已知轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子SREBP2和其轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子PCSK9的基因表達(dá)量均沒(méi)有明顯變化。
　　9.我們?cè)O(shè)計(jì)了含有SRE序列的LDLR啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒，利用HepG2細(xì)胞系，通過(guò)轉(zhuǎn)染SREBP2質(zhì)粒及FoxO6病毒來(lái)觀察FoxO6對(duì)LDLR的調(diào)控作用。結(jié)果顯示，SREBP2可顯著上調(diào)HepG2細(xì)

11、胞內(nèi)LDLR的表達(dá)，而這種上調(diào)作用在加入FoxO6病毒后減弱，并與FoxO6病毒濃度呈劑量依賴效應(yīng)。染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)(ChIP assay)顯示，在加入FoxO6病毒后，SREBP2與LDLR啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合DNA擴(kuò)增條帶較空白病毒組顯著減弱。
　　結(jié)論：
　　1.慢性應(yīng)激可導(dǎo)致小鼠NAFLD的發(fā)生;這種作用可能是通過(guò)增加肝臟內(nèi)甘油三酯合成，促進(jìn)脂肪組織分解，增加機(jī)體炎癥反應(yīng)來(lái)介導(dǎo)的，IRS2-Akt-FoxO1通路可能在其

12、中起重要作用;
　　2.FoxO6可通過(guò)減少SREBP2與LDLR啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合來(lái)降低LDLR的表達(dá)，導(dǎo)致血液中膽固醇不能被內(nèi)吞入肝臟代謝，形成高甘油三酯血癥。
　　全文小結(jié)：本文通過(guò)研究FoxO蛋白在應(yīng)激致非酒精性脂肪肝(NAFLD)及高膽固醇血癥中的作用，發(fā)現(xiàn)了FoxO蛋白作為轉(zhuǎn)錄因子，可能通過(guò)調(diào)控甘油三酯合成相關(guān)基因及肝臟攝取膽固醇的受體表達(dá)量來(lái)導(dǎo)致NAFLD及高膽固醇血癥的發(fā)生，在脂質(zhì)代謝紊亂中起重要調(diào)控作用。Fox