高糖誘導(dǎo)髓核細(xì)胞凋亡的相關(guān)研究.pdf

1、背景及目的：細(xì)胞凋亡參存在于機(jī)體的整個(gè)生命過程，參與了生命過程中的各種生理及病理過程。細(xì)胞凋亡的增加或者減少是許多疾病的發(fā)病基礎(chǔ)。目前研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)除了參與機(jī)體正常的生命活動(dòng)，也參與了細(xì)胞的凋亡過程，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑成為新的凋亡通路。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡通路的主要機(jī)制是各種理化因素導(dǎo)致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress,ERS）。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在細(xì)胞生命過程中發(fā)揮重要作用，其主要功能是參與蛋白質(zhì)的折疊、修飾及合成。當(dāng)內(nèi)

2、質(zhì)網(wǎng)受到內(nèi)外理化因素刺激時(shí)，會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的代謝及合成障礙。當(dāng)理化因素強(qiáng)烈、持續(xù)存在時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)紊亂，積累大量的未折疊或折疊錯(cuò)誤的蛋白質(zhì)后，會(huì)激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。當(dāng)椎間盤髓核組織中髓核細(xì)胞大量凋亡時(shí)，即可引起椎間盤退變，進(jìn)而導(dǎo)致一些列脊椎退行性疾病的發(fā)生。本研究旨在通將髓核細(xì)胞培養(yǎng)于含有高濃度葡萄糖的培養(yǎng)基中，探討在高糖環(huán)境中，ERS是否參與誘導(dǎo)兔髓核細(xì)胞的凋亡過程。
　　方法：本實(shí)驗(yàn)采用胰酶聯(lián)合Ⅱ型膠原酶消化法

3、，體外分離、培養(yǎng)兔髓核細(xì)胞，經(jīng)過甲苯胺藍(lán)染色、蘇木精-伊紅染色后觀察細(xì)胞形態(tài)。通過細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色、免疫熒光染色鑒定髓核細(xì)胞后，將第三代兔髓核細(xì)胞隨機(jī)分為四組，包括：對(duì)照組（正常培養(yǎng)基組）、高糖組（培養(yǎng)基中含有100mM葡萄糖）、Caspase-12抑制劑組（培養(yǎng)基中含有2μM氟甲基酮）和高糖+Caspase-12抑制劑組（培養(yǎng)基中含有2μM氟甲基酮及100mM葡萄糖），每組細(xì)胞按照不同的實(shí)驗(yàn)條件處理6h后，分別采用CCK-8試劑盒

4、和細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖活性及凋亡情況，ROS檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)的總活性氧（reactive oxygen species，ROS），PCR和Western-blot檢測(cè)各組Caspase-12和Grp78的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：成功完成了兔髓核細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)；髓核細(xì)胞染色后鏡下觀察呈多角形、短梭形，有一到兩個(gè)核仁，隨著傳代次數(shù)增加，細(xì)胞伸出偽足，胞體逐漸變細(xì)長(zhǎng)；體外分離培養(yǎng)髓核細(xì)胞可穩(wěn)定表達(dá)Ⅱ型膠原蛋白。