敲低TXNIP對高糖誘導小鼠系膜細胞凋亡的影響.pdf

1、目的：糖尿病腎病(DN)是最常見的糖尿病微血管并發(fā)癥，一旦腎臟發(fā)生損害往往造成不可逆進展。在需要透析的臨床病人中，DN患者大約占20％～40％。所以如果能夠實現(xiàn)DN的早期診斷與治療，對于提高患者的生活質量及改善預后有著重要的臨床意義。目前對于DN的發(fā)病機制尚不清楚，通過大量的研究證實氧化應激在DN的發(fā)病機制中發(fā)揮了非常重要的作用。硫氧還蛋白(thioredoxin，TRX)是一種具有氧化還原活性的小分子蛋白，TRX與TRX還原酶及還原型

2、煙酰腺嘌呤二核苷磷酸(NADPH)一起組成一個分布廣泛的NADPH依賴性二硫化物還原酶-TRX系統(tǒng)。具有調節(jié)細胞氧化還原狀態(tài)、對抗氧化應激、激活轉錄因子、促進細胞生長以及抑制細胞凋亡等作用。硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxin interacting protein，TXNIP)又稱維生素D3上調蛋白1(VDUP-1)或TRX結合蛋白2(TBP-2)，屬于硫氧還蛋白結合蛋白的家族成員，通過抑制硫氧還蛋白系統(tǒng)的功能而發(fā)揮介導氧化

3、應激、抑制細胞增殖及誘導細胞凋亡等作用，是TRX的負性調節(jié)因子。以往的研究證明TXNIP參與高糖誘導的胰島β細胞凋亡及糖尿病相關性心肌細胞凋亡。然而，TXNIP在高糖誘導下小鼠系膜細胞凋亡中的作用還未見報道。在本實驗中，我們應用體外培養(yǎng)的小鼠系膜細胞，采用TXNIP小干擾RNA敲低TXNIP表達，觀察其對高糖誘導的系膜細胞凋亡、cleaved caspase-3表達以及Bax/Bcl-2比率的影響。
　　方法：構建針對TXNIP的

4、siRNA干擾質粒pBAsim-U6-Neo-TXNIPsiRNA，使用Lipofectamine2000轉染試劑將TXNIP siRNA質粒和對照質粒分別轉染MMCs，經(jīng)G418篩選穩(wěn)定的MMCs細胞系。以正常糖濃度(NG)和NG加甘露醇培養(yǎng)的MMCs為對照，以HG刺激MMCs，采用抗氧化劑(Tempol)處理MMCs。流式細胞儀檢測細胞內的ROS水平，TUNEL法檢測凋亡細胞數(shù)目，RT-PCR檢測細胞Bax和Bcl-2的mRNA的表

5、達。蛋白印跡法檢測細胞內cleaved caspase-3、caspase-3、Bax、Bcl-2、β-actin和TXNIP的表達。
　　結果：
　　1高糖對MMC的凋亡的影響。與正常糖濃度及對照組相比，高糖能夠明顯誘導系膜細胞凋亡。與正常糖濃度及對照組相比，高糖組Bax/Bcl-2mRNA和蛋白比率明顯升高。另外，甘露醇對細胞凋亡、Bax/Bcl-2 mRNA和蛋白比率無明顯影響。
　　2高糖對系膜細胞cleave

6、d caspase-3表達的影響。Cleaved caspase-3在高糖條件下培養(yǎng)的小鼠系膜細胞表達呈時間依賴性。在高糖作用12小時cleaved caspase-3表達開始升高，48小時維持高水平。
　　3敲低TXNIP表達對高糖誘導的MMC凋亡的影響。與高糖組和載體對照組相比，TXNIP siRNA轉染組TXNIP蛋白水平明顯降低，證實TXNIPsiRNA對系膜細胞TXNIP抑制效果明顯。與高糖組和載體對照組相比，TXNIP

7、 siRNA轉染組細胞凋亡數(shù)顯著減少?？寡趸瘎﹖empol也能夠抑制高糖誘導的系膜細胞凋亡。同樣，轉染TXNIP siRNA質粒或tempol均能夠下調高糖條件下Bax/Bcl-2 mRNA和蛋白的比率。
　　4敲低TXNIP表達對高糖誘導cleaved caspase-3表達的影響。與NG組相比，HG組cleaved caspase-3的表達明顯升高。轉染TXNIP siRNA質粒或tempol處理后，高糖誘導的cleaved

8、caspase-3高表達明顯被抑制。
　　5敲低TXNIP表達對高糖誘導ROS產(chǎn)生的影響。與NG組相比，HG組ROS水平明顯提高。甘露醇對照組與NG組相比ROS表達無明顯變化。轉染TXNIP siRNA質粒或tempol處理能夠明顯下調高糖誘導的ROS產(chǎn)生。
　　結論：
　　1 TXNIP參與了HG誘導的MMC細胞凋亡。
　　2敲低TXNIP表達能夠減少HG誘導的細胞凋亡及cleaved caspase-3、Ba