敲低TXNIP對(duì)高糖誘導(dǎo)小鼠系膜細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、目的：糖尿病腎病(DN)是最常見的糖尿病微血管并發(fā)癥，一旦腎臟發(fā)生損害往往造成不可逆進(jìn)展。在需要透析的臨床病人中，DN患者大約占20％～40％。所以如果能夠?qū)崿F(xiàn)DN的早期診斷與治療，對(duì)于提高患者的生活質(zhì)量及改善預(yù)后有著重要的臨床意義。目前對(duì)于DN的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，通過大量的研究證實(shí)氧化應(yīng)激在DN的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了非常重要的作用。硫氧還蛋白(thioredoxin，TRX)是一種具有氧化還原活性的小分子蛋白，TRX與TRX還原酶及還原型

2、煙酰腺嘌呤二核苷磷酸(NADPH)一起組成一個(gè)分布廣泛的NADPH依賴性二硫化物還原酶-TRX系統(tǒng)。具有調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原狀態(tài)、對(duì)抗氧化應(yīng)激、激活轉(zhuǎn)錄因子、促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)以及抑制細(xì)胞凋亡等作用。硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxin interacting protein，TXNIP)又稱維生素D3上調(diào)蛋白1(VDUP-1)或TRX結(jié)合蛋白2(TBP-2)，屬于硫氧還蛋白結(jié)合蛋白的家族成員，通過抑制硫氧還蛋白系統(tǒng)的功能而發(fā)揮介導(dǎo)氧化

3、應(yīng)激、抑制細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等作用，是TRX的負(fù)性調(diào)節(jié)因子。以往的研究證明TXNIP參與高糖誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡及糖尿病相關(guān)性心肌細(xì)胞凋亡。然而，TXNIP在高糖誘導(dǎo)下小鼠系膜細(xì)胞凋亡中的作用還未見報(bào)道。在本實(shí)驗(yàn)中，我們應(yīng)用體外培養(yǎng)的小鼠系膜細(xì)胞，采用TXNIP小干擾RNA敲低TXNIP表達(dá)，觀察其對(duì)高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞凋亡、cleaved caspase-3表達(dá)以及Bax/Bcl-2比率的影響。
　　方法：構(gòu)建針對(duì)TXNIP的

4、siRNA干擾質(zhì)粒pBAsim-U6-Neo-TXNIPsiRNA，使用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑將TXNIP siRNA質(zhì)粒和對(duì)照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染MMCs，經(jīng)G418篩選穩(wěn)定的MMCs細(xì)胞系。以正常糖濃度(NG)和NG加甘露醇培養(yǎng)的MMCs為對(duì)照，以HG刺激MMCs，采用抗氧化劑(Tempol)處理MMCs。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，TUNEL法檢測(cè)凋亡細(xì)胞數(shù)目，RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞Bax和Bcl-2的mRNA的表

5、達(dá)。蛋白印跡法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)cleaved caspase-3、caspase-3、Bax、Bcl-2、β-actin和TXNIP的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1高糖對(duì)MMC的凋亡的影響。與正常糖濃度及對(duì)照組相比，高糖能夠明顯誘導(dǎo)系膜細(xì)胞凋亡。與正常糖濃度及對(duì)照組相比，高糖組Bax/Bcl-2mRNA和蛋白比率明顯升高。另外，甘露醇對(duì)細(xì)胞凋亡、Bax/Bcl-2 mRNA和蛋白比率無明顯影響。
　　2高糖對(duì)系膜細(xì)胞cleave

6、d caspase-3表達(dá)的影響。Cleaved caspase-3在高糖條件下培養(yǎng)的小鼠系膜細(xì)胞表達(dá)呈時(shí)間依賴性。在高糖作用12小時(shí)cleaved caspase-3表達(dá)開始升高，48小時(shí)維持高水平。
　　3敲低TXNIP表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的MMC凋亡的影響。與高糖組和載體對(duì)照組相比，TXNIP siRNA轉(zhuǎn)染組TXNIP蛋白水平明顯降低，證實(shí)TXNIPsiRNA對(duì)系膜細(xì)胞TXNIP抑制效果明顯。與高糖組和載體對(duì)照組相比，TXNIP

7、 siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡數(shù)顯著減少?？寡趸瘎﹖empol也能夠抑制高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞凋亡。同樣，轉(zhuǎn)染TXNIP siRNA質(zhì)?；騮empol均能夠下調(diào)高糖條件下Bax/Bcl-2 mRNA和蛋白的比率。
　　4敲低TXNIP表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)cleaved caspase-3表達(dá)的影響。與NG組相比，HG組cleaved caspase-3的表達(dá)明顯升高。轉(zhuǎn)染TXNIP siRNA質(zhì)?；騮empol處理后，高糖誘導(dǎo)的cleaved

8、caspase-3高表達(dá)明顯被抑制。
　　5敲低TXNIP表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生的影響。與NG組相比，HG組ROS水平明顯提高。甘露醇對(duì)照組與NG組相比ROS表達(dá)無明顯變化。轉(zhuǎn)染TXNIP siRNA質(zhì)?；騮empol處理能夠明顯下調(diào)高糖誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生。
　　結(jié)論：
　　1 TXNIP參與了HG誘導(dǎo)的MMC細(xì)胞凋亡。
　　2敲低TXNIP表達(dá)能夠減少HG誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡及cleaved caspase-3、Ba