去細(xì)胞髓核支架的制備及相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、腰痛是發(fā)病率僅次于上呼吸道感染的一種常見病，而椎間盤退變性疾病(DDD)是引起腰痛的主要原因。椎間盤退變(IVDD)是導(dǎo)致脊柱解剖和功能紊亂的重要原因，是一系列脊柱退行性疾病的病理基礎(chǔ)。尤其是隨著社會(huì)老齡化進(jìn)程加快，因其導(dǎo)致的脊柱疾患發(fā)病率越來越高，輕者引起慢性頸臂痛或腰腿痛，重者則導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙甚至截癱，對(duì)個(gè)人、家庭及社會(huì)造成了沉重的負(fù)擔(dān)。因此，椎間盤退變已成為當(dāng)前多學(xué)科研究的熱點(diǎn)。
　　 盡管國內(nèi)外對(duì)椎間盤退變的發(fā)生、發(fā)展

2、及治療進(jìn)行了廣泛而深入的基礎(chǔ)和臨床研究，但由于椎間盤退變是多因素參與的復(fù)雜過程，目前臨床上既無有效的方法阻止其發(fā)生和發(fā)展，又無理想的措施來對(duì)椎間盤退變本身進(jìn)行有效的治療。而現(xiàn)今許多治療方法可謂冶標(biāo)不治本，并不能起到阻止或者逆轉(zhuǎn)椎間盤退變的作用。例如目前治療椎間盤突出癥主要采用手術(shù)摘除或者化學(xué)溶解髓核組織，因退變而致的脊柱不穩(wěn)則采用植骨融合、人工椎間盤置換等，這些方法雖然在一定程度上暫時(shí)緩解了椎間盤退行性病變引起的癥狀，但同時(shí)也會(huì)造成脊柱

3、解剖結(jié)構(gòu)和功能的破壞，并可能引起許多并發(fā)癥，遠(yuǎn)期效果并不理想。研究發(fā)現(xiàn)，髓核退變及損傷是導(dǎo)致椎間盤退行性病變的重要原因，其組織病理特征主要為:髓核水分減少，蛋白聚糖含量下降，細(xì)胞外基質(zhì)凝膠狀和靜力學(xué)特征性改變;髓核組織外部的纖維環(huán)膠原纖維薄層結(jié)構(gòu)紊亂，出現(xiàn)小裂隙，并向外呈放射狀;髓核細(xì)胞調(diào)亡，細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞外基質(zhì)的性狀改變影響到細(xì)胞營養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸和氧代謝的正常進(jìn)行，導(dǎo)致髓核細(xì)胞外環(huán)境酸化，進(jìn)一步加劇了髓核細(xì)胞的死亡。最終反映為椎間盤

4、細(xì)胞數(shù)量減少及功能減退，細(xì)胞外基質(zhì)不足及成份發(fā)生改變，進(jìn)而引起機(jī)體椎間盤在結(jié)構(gòu)和功能上發(fā)生改變，因而椎間盤的形態(tài)與功能無法得到正常維持。
　　 目前治療DDD的方法包括保守治療和手術(shù)治療。其中保守治療包括臥床休息、止痛、肌松類藥物治療、局部封閉以及按摩等，然而所有這些治療方式主要為姑息治療。常規(guī)的髓核摘除和脊柱融合術(shù)等手術(shù)治療雖然通過摘除病變的椎間盤組織或者犧牲脊柱局部節(jié)段的活動(dòng)度來換取癥狀的解除，然而從根本上并沒有修復(fù)退變的椎

5、間盤組織和恢復(fù)椎間盤的生理功能。傳統(tǒng)的椎間盤退變性疾病的治療方法以減輕繼發(fā)性損傷為主，而缺乏誘導(dǎo)退變椎間盤進(jìn)行主動(dòng)修復(fù)的有效手段。近年來，隨著國內(nèi)外組織工程技術(shù)和方法的不斷發(fā)展與創(chuàng)新，這方面的研究已成為熱點(diǎn)，相關(guān)的報(bào)道也越來越多，在某些領(lǐng)域的技術(shù)及理論日趨成熟。因此依據(jù)國內(nèi)外已有研究成果，以椎間盤髓核組織為突破口，利用組織工程技術(shù)修復(fù)、重建退變髓核組織，促進(jìn)髓核再生，進(jìn)而達(dá)到逆轉(zhuǎn)甚至治愈椎間盤退行性疾病的目的，這種新方法新思路或許將為椎

6、間盤退行性疾病的治療帶來新的希望。據(jù)報(bào)道，NPR[9-11](NPR)為退變性腰椎間盤疾病提供了一種有效的治療途徑，可保留手術(shù)節(jié)段活動(dòng)功能，短期隨訪療效好。近年來的NPR展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景，然而與該技術(shù)相關(guān)的許多并發(fā)癥和缺陷依然需要克服。選擇更加符合人體腰椎間盤的生物學(xué)和力學(xué)特性的假體材料，避免手術(shù)相關(guān)的并發(fā)癥，研究微創(chuàng)的置入方法以及避免手術(shù)并發(fā)癥，仍是需要深入研究和關(guān)注的課題。目前沒有任何一種外科治療手段旨在從根本上解決椎間盤退變所

7、帶來的生物學(xué)功能丟失。在椎間盤髓核組織工程領(lǐng)域，生長因子和支架是目前的研究熱點(diǎn)，而且許多學(xué)者已經(jīng)意識(shí)到單純依靠某種細(xì)胞或生長因子難以徹底解決椎間盤退變冶療中所遇到的問題，對(duì)于椎間盤退變的治療應(yīng)包括組織水平的重建，整合冶療研究的各種有效策略，誘導(dǎo)種子細(xì)胞分化為髓核細(xì)胞并分泌足夠細(xì)胞外基質(zhì)，從而維持或改善椎間盤的功能。因此，具有生理椎間盤或NP組織結(jié)構(gòu)和功能的生物學(xué)植入物被認(rèn)為可能是重建退變椎間盤和治療椎間盤退變性疾病的一種理想替代品。

8、r>　　 近些年來組織工程學(xué)的迅速發(fā)展使得應(yīng)用組織工程化椎間盤治療椎間盤退變性疾病成為可能。椎間盤組織工程就是通過生物學(xué)手段，體外培養(yǎng)構(gòu)建功能性的椎間盤組織單位并植入體內(nèi)，進(jìn)而替代重建原有退變椎間盤的生物功能。在椎間盤的三個(gè)解剖組分中（纖維環(huán)、髓核、終板），NP是由隨機(jī)排列的膠原蛋白纖維、放射狀排列的彈性纖維以及蛋白聚糖(PG)組成的高度水化的凝膠樣組織。其中PG成分可以結(jié)合水分子，維持髓核組織的滲透壓，因此其在椎間盤承載壓力載荷的功

9、能中發(fā)揮著重要的作用。此外椎間盤退變性疾病被認(rèn)為起源于髓核組織中蛋白聚糖和含水量的逐漸丟失，因此目前絕大多數(shù)的組織工程椎間盤研究集中在對(duì)退變髓核的治療上。
　　 常規(guī)的臨床治療手段較難恢復(fù)其結(jié)構(gòu)和功能，而利用組織工程學(xué)方法重建具有生物學(xué)功能髓核組織成為研究方向之一。目前雖然眾多學(xué)者大量研究探索了應(yīng)用于髓核組織工程的支架材料，然而幾乎沒有文獻(xiàn)報(bào)道能制備出能夠完全模擬天然髓核內(nèi)環(huán)境的支架材料。由于組織工程支架材料的主要功能是盡量模仿

10、所植入部位的生物學(xué)環(huán)境。在組織工程的三個(gè)主要組分中（種子細(xì)胞、支架材料、信號(hào)分子），支架材料扮演著載體的角色。在所植入的體內(nèi)不利環(huán)境中，為種子細(xì)胞提供一個(gè)臨時(shí)性的庇護(hù)所。此外支架材料必須能夠促進(jìn)種子細(xì)胞的粘附、增殖、相關(guān)基因的表達(dá)以及新的功能性的細(xì)胞外基質(zhì)的合成。
　　 髓核組織工程支架是髓核組織工程的重要組成部分。構(gòu)建的髓核組織工程支架應(yīng)模擬髓核的生長環(huán)境，為種子細(xì)胞提供粘附增殖的空間，可促進(jìn)細(xì)胞的增殖分化，最終形成人造髓核(

11、ANP)。組織工程支架主要分為天然生物材料支架和人工合成材料支架。如何利用組織工程髓核支架對(duì)退變的椎間盤進(jìn)行生物修復(fù)一直是影響臨床治療效果的難點(diǎn)，也是目前的研究熱點(diǎn)，并且已經(jīng)獲得較大進(jìn)展。但是，目前組織工程髓核支架存在諸多問題，難以應(yīng)用于臨床。鑒于此，本課題從全新的角度以兔髓核為原材料，通過對(duì)其進(jìn)行脫細(xì)胞處理，制備了全新的脫細(xì)胞髓核支架，既去除了異種異體的髓核細(xì)胞，降低免疫原性，同時(shí)又保留了天然髓核支架的空間結(jié)構(gòu)及細(xì)胞外基質(zhì)成份。通過本

12、實(shí)驗(yàn)研制全新天然髓核支架，為構(gòu)建具有天然髓核基質(zhì)結(jié)構(gòu)的組織工程化髓核提供全新思路。
　　 第一部分萃取法制備去細(xì)胞髓核支架最佳條件的初步優(yōu)化研究
　　 目的：探討機(jī)械振蕩和去污劑濃度對(duì)髓核去細(xì)胞支架形態(tài)學(xué)的影響，建立一種髓核脫細(xì)胞的優(yōu)化處理方法。
　　 方法：取成年兔髓核35段分成A組、B組、C組（含C1/C2/C3子組）、D組、E組（正常對(duì)照組），A、B、C、D四組每組5段用Triton X-100和脫氧膽酸鈉

13、溶液進(jìn)行化學(xué)處理，四組振蕩頻率分別為0、80、130、180r/min，其中C組中三個(gè)子組(C1/C2/C3)的Triton X-100、脫氧膽酸鈉的濃度分別都為1％、3％、5％，其余各組的濃度均為3％。對(duì)萃取后的髓核及正常組織行石蠟切片、HE染色和掃描電鏡觀察，比較萃取后細(xì)胞清除情況和髓核基質(zhì)形態(tài)學(xué)變化。
　　 結(jié)果：A組、B組及C1組去細(xì)胞髓核內(nèi)殘留大量脫髓核細(xì)胞胞體或者核物質(zhì)，C2、C3組及D組髓核萃取后細(xì)胞胞體被徹底清除

14、。去細(xì)胞髓核為一種無細(xì)胞的基質(zhì)纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，但是C2組和D組髓核內(nèi)基質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯破壞。
　　 結(jié)論：合適的機(jī)械振蕩頻率及萃取劑濃度在脫去髓核細(xì)胞的同時(shí)還能較好地保存髓核內(nèi)天然的基質(zhì)纖維和三維空間結(jié)構(gòu)，為構(gòu)建組織工程化髓核提供理想的支架材料。
　　 第二部分兩種脫細(xì)胞髓核支架制備方法的對(duì)比研究
　　 目的：對(duì)比去污劑——脫氧膽酸鈉法、酶消化法（DNA酶與RNA酶）脫去髓核組織中的髓核細(xì)胞的效果及保護(hù)細(xì)胞外基質(zhì)

15、的能力，為組織工程髓核的構(gòu)建提供較理想的支架材料。
　　 方法：以2種脫細(xì)胞處理方法處理新鮮的兔髓核組織，然后用光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡、掃描電鏡、觀察髓核組織的脫細(xì)胞的效果和細(xì)胞外基質(zhì)（如膠原纖維）的變化情況;熱皺縮實(shí)驗(yàn)測(cè)試基質(zhì)的物理性能的變化;DNA提取比較脫細(xì)胞前后細(xì)胞的數(shù)量的不同。
　　 結(jié)果：此兩種處理方法皆能完全脫去髓核細(xì)胞，但是與去污劑——脫氧膽酸鈉法相比，酶消化處理方法對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的破壞作用更明顯。

16、　　 結(jié)論：去污劑——脫氧膽酸鈉法不僅脫細(xì)胞的效果良好，而且具有較好的保護(hù)細(xì)胞外基質(zhì)的能力。因而本法可能是制備脫細(xì)胞髓核支架的一種比較理想的制備方法。
　　 第三部分兩種不同方法制備的脫細(xì)胞髓核支架的體外降解及生物力學(xué)研究
　　 目的:研究經(jīng)不同脫細(xì)胞方法制備的髓核支架在體外降解過程中進(jìn)行生物力學(xué)測(cè)試，比較不同脫細(xì)胞支架的力學(xué)性能差異，為進(jìn)一步的臨床實(shí)驗(yàn)研究提供依據(jù)。
　　 方法:將用單純萃取法（去污劑法）、D

17、NA&RNA酶法以及正常的髓核在37度生理鹽水中降解觀察10周，每周進(jìn)行體積、質(zhì)量丟失及在生物力學(xué)測(cè)試機(jī)上進(jìn)行壓縮模量試驗(yàn)，記錄相關(guān)數(shù)據(jù)，同時(shí)觀察支架表面形態(tài)變化。
　　 結(jié)果:兩組脫細(xì)胞髓核支架的質(zhì)量丟失和體積變化有顯著差異。其支架抗壓強(qiáng)度于第0周時(shí)，單純萃取法組與正常髓核組相比無明顯差異，而DNA&RNA酶法組與正常髓核組有顯著差異，其抗壓強(qiáng)度明顯下降;第6～7周時(shí)兩組皆減至原來的一半。在8～10周觀察期間，兩組表面形態(tài)發(fā)生