雄激素對(duì)小鼠海馬突觸蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)及其機(jī)制的初步研究.pdf

1、阿爾茲海默病(Alzheimer's disease，AD)，又被稱(chēng)做老年癡呆，是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性病，起病隱匿，病程呈慢性進(jìn)行性。目前，全球AD患者人數(shù)已近2000萬(wàn)，且患病人數(shù)仍然在增加。我國(guó)65歲以上老人發(fā)病率為5％，75歲以上老人發(fā)病率為10％，85歲以上發(fā)病率達(dá)到20％。主要表現(xiàn)為一系列的神經(jīng)精神癥狀如漸進(jìn)性認(rèn)知功能和記憶障礙、人格和行為改變以及語(yǔ)言障礙等，是當(dāng)今老齡化社會(huì)極難解決的醫(yī)學(xué)難題之一。雖然近年在其治療方面有一定的

2、突破，但對(duì)正在飽受煎熬的老年癡呆癥患者來(lái)說(shuō)，宛如杯水車(chē)薪，并沒(méi)有實(shí)際上的改變。這不僅給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)，對(duì)家庭護(hù)理和臨床護(hù)理工作也帶來(lái)嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。
　　已有研究證明認(rèn)知功能的下降與雄激素水平降低有關(guān)，其調(diào)節(jié)腦結(jié)構(gòu)與功能有兩種方式，一種是通過(guò)雄激素受體的直接作用方式，二是在芳香化酶催化下轉(zhuǎn)化為雌激素（內(nèi)源性雌激素）進(jìn)而通過(guò)雌激素受體（核受體ERα，ERβ和膜性受體GPR30）的間接方式。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)向雄性小鼠

3、腹腔注射芳香化酶抑制劑LET抑制芳香化酶的活性可誘導(dǎo)突觸蛋白的表達(dá)下降與學(xué)習(xí)記憶行為的顯著改變，而卵巢切除僅可導(dǎo)致突觸蛋白的輕微下調(diào)但是并無(wú)學(xué)習(xí)記憶行為的顯著改變，提示雄激素的內(nèi)源性雌激素作用途徑可能在調(diào)節(jié)突觸可塑性尤其是影響學(xué)習(xí)記憶方面發(fā)揮了主要作用，但是其具體的調(diào)節(jié)途徑猶未可知，雄激素對(duì)海馬突觸可塑性的調(diào)節(jié)究竟涉及到哪一種或哪幾種受體尚不清楚。
　　已有研究表明雄激素等神經(jīng)類(lèi)固醇激素可通過(guò)其核受體影響神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能。核受

4、體調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄則需類(lèi)固醇受體輔助活化因子-1(steroid receptor coactivator-1，SRC-1)等輔助活化因子的參與。SRC-1能以配體依賴(lài)方式顯著增強(qiáng)多種核受體的轉(zhuǎn)錄活性，抑制腦內(nèi)SRC-1的表達(dá)則可導(dǎo)致腦發(fā)育、行為和生理性改變等。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中類(lèi)固醇激素作用的重要功能區(qū)域是海馬，SRC-1在小鼠海馬細(xì)胞核內(nèi)也有高表達(dá)，其被證實(shí)在大腦突觸可塑性、學(xué)習(xí)記憶等高級(jí)認(rèn)知活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用。然而在海馬，SRC-1

5、是否介導(dǎo)了雄激素對(duì)海馬突觸蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。
　　基于以上問(wèn)題，我們通過(guò)在體經(jīng)典的睪丸切除模型模擬老化后雄激素水平降低，采用免疫組化和Westen Blot技術(shù)檢測(cè)了在睪丸切除后給予0.5mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg的丙酸睪酮(Testosterone，T)分別處理2周、4周后海馬AMPA受體亞型谷氨酸受體-1(GluR1)、突觸后致密物蛋白-95(Postsynaptic density prote

6、in-95，PSD-95)、雄激素受體(Androgen Receptor，AR)、雌激素核受體(Estrogen Receptor，ERα、Estrogen Receptor，ERβ)、雌激素膜受體(G Protein-coupled Receptor30，GPR30)、SRC-1的表達(dá)變化以明確雄激素水平下降與學(xué)習(xí)記憶認(rèn)知的關(guān)系。之后我們采用離體實(shí)驗(yàn)，加入各受體及SRC-1抑制劑檢測(cè)以上相關(guān)突觸蛋白及受體表達(dá)的變化，并采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

7、進(jìn)行了相關(guān)性分析，以初步探討雄激素調(diào)節(jié)海馬突觸蛋白表達(dá)的機(jī)制，以期為深入闡明老年癡呆的發(fā)病機(jī)制以及開(kāi)發(fā)更有效的預(yù)防或治療老年癡呆的藥物提供新的基礎(chǔ)資料，為護(hù)理同仁大大減輕工作負(fù)擔(dān)。
　　主要結(jié)果:
　　1、GluR1、PSD-95、AR、ERα、ERβ、SRC-1在成年雄性小鼠海馬區(qū)均有廣泛表達(dá)，在去勢(shì)后其表達(dá)均有顯著降低，給予不同時(shí)間不同劑量雄激素替代后各分子有著不同的變化。GPR30和樹(shù)突棘素Spinophilin(Sp

8、ino)在去勢(shì)后表達(dá)未有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　2、去勢(shì)給予短時(shí)雄激素替代后（劑量0.5mg/kg,1.0mg/kg，2.0mg/kg），海馬區(qū)突觸蛋白GluR1在0.5mg/kg的劑量下表達(dá)較去勢(shì)組略有上升，在1.0mg/kg的劑量下表達(dá)則顯著上升，而在2.0mg/kg的劑量下表達(dá)則又降低。突觸蛋白PSD-95在0.5mg/kg的劑量下表達(dá)較去勢(shì)組有上升，在1.0mg/kg的劑量下表達(dá)則顯著上升，而在2.0mg/kg的劑量下仍在較高水

9、平。核受體AR、ERα、ERβ在0.5mg/kg的劑量下表達(dá)較去勢(shì)組略有上升，在1.0mg/kg的劑量下表達(dá)則顯著上升，而在2.0mg/kg的劑量下表達(dá)則又降低。SRC-1在0.5mg/kg的劑量下SRC-1表達(dá)較去勢(shì)組略有上升，在1.0mg/kg的劑量下表達(dá)則顯著上升，而在2.0mg/kg的劑量下則表達(dá)有所降低。而GPR30和Spino的變化則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　3、去勢(shì)給予長(zhǎng)時(shí)雄激素替代后(劑量0.5mg/kg，1.0mg/k

10、g，2.0mg/kg)，海馬區(qū)突觸蛋白GluR1、PSD-95在0.5mg/kg的劑量下表達(dá)較去勢(shì)組略有上升，在1.0mg/kg的劑量下表達(dá)則顯著上升，而在2.0mg/kg的劑量下表達(dá)則又降低。核受體AR在0.5mg/kg的劑量下表達(dá)較去勢(shì)組略有上升，在1.0mg/kg的劑量下表達(dá)則顯著上升，而在2.0mg/kg的劑量下表達(dá)則又降低。核受體ERβ在0.5mg/kg和1.0mg/kg的劑量下表達(dá)較去勢(shì)組略有上升，而在2.0mg/kg的劑量

11、下表達(dá)有顯著升高。GPR30在雄激素替代劑量為1.0mg/kg時(shí)其表達(dá)有顯著升高。SRC-1在0.5mg/kg的劑量下SRC-1表達(dá)較去勢(shì)組略有上升，在1.0mg/kg的劑量下表達(dá)則顯著上升，而在2.0mg/kg的劑量下則表達(dá)有所降低。而ERα和Spino的變化則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　4、去勢(shì)短時(shí)雄激素替代，雄性小鼠海馬內(nèi)AR、ERα、ERβ表達(dá)的變化與GluR1和PSD-95存在高度一致的線性相關(guān)關(guān)系;AR、 ERα、ERβ表達(dá)的

12、變化與SRC-1存在高度一致的線性相關(guān)關(guān)系;SRC-1表達(dá)的變化與GluR1、PSD-95存在高度一致的線性相關(guān)關(guān)系。去勢(shì)長(zhǎng)時(shí)雄激素替代，雄性小鼠海馬內(nèi)AR表達(dá)的變化與ERβ、GluR1均存在高度一致的線性相關(guān)關(guān)系;SRC-1表達(dá)的變化與GluR1存在高度一致的線性相關(guān)關(guān)系。
　　5、離體實(shí)驗(yàn)中，給予海馬神經(jīng)元細(xì)胞株適量雄激素處理，突觸蛋白GluR1和PSD-95、SRC-1的表達(dá)均有所上升，而GluR1在加入AR拮抗劑Fluta

13、mide(Flu)、ERα拮抗劑MPP、ERβ拮抗劑PHTPP(PHT)后表達(dá)明顯下降，PSD-95在加入Flu、MPP、PHT、G15后均有表達(dá)下降，SRC-1在Flu、MPP、G15后均有表達(dá)下降，Spino則無(wú)明顯變化。在給予海馬神經(jīng)元細(xì)胞株適量雄激素處理的基礎(chǔ)上給予SRC-1抑制劑bufalin(Bu)，GluR1、PSD-95 AR、ERβ在給予適量雄激素后較溶劑對(duì)照組明顯升高，在給予Bu后AR、ERα、ERβ、GPR30、G

14、luR1和PSD-95表達(dá)明顯下降。Spino表達(dá)略微下降，卻無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　主要結(jié)論:
　　1、睪丸切除能降低成年雄性小鼠海馬突觸蛋白GluR1、PSD-95的表達(dá)，給予雄激素替代后則明顯上升，結(jié)合離體實(shí)驗(yàn)中給予適量雄激素后海馬神經(jīng)元GluR1、PSD-95表達(dá)升高，提示在一定時(shí)間和劑量下雄激素可正向調(diào)節(jié)海馬突觸蛋白的表達(dá)，進(jìn)而影響其突觸可塑性。
　　2、睪丸切除能降低成年雄性小鼠海馬核受體AR、ERα、ERβ，

15、給予雄激素替代后則明顯上升，且AR、ERα、ERβ的變化趨勢(shì)與GluR1、PSD-95的變化趨勢(shì)高度相關(guān)，結(jié)合離體實(shí)驗(yàn)中，給予Flu、MPP、PHT均可致GluR1、 PSD-95表達(dá)降低，提示雄激素可通過(guò)其直接受體途徑AR和間接受體途徑ERα、ERβ調(diào)節(jié)突觸蛋白的表達(dá)。
　　3、睪丸切除后能降低成年雄性小鼠海馬SRC-1的表達(dá)，給予雄激素替代后則明顯上升，且SRC-1的變化趨勢(shì)與核受體AR、ERα、ERβ及突觸蛋白GluR1、P

16、SD-95的變化趨勢(shì)呈高度相關(guān)。結(jié)合離體實(shí)驗(yàn)中，給予Bu后AR、ERα、ERβ、GPR30及突觸蛋白GluR1、PSD-95均表達(dá)下降，提示SRC-1可能在雄激素通過(guò)其直接受體途徑AR和間接受體途徑ERα、ERβ和/或GPR30調(diào)節(jié)海馬突觸發(fā)生中具有重要介導(dǎo)作用。這種調(diào)節(jié)可能進(jìn)一步導(dǎo)致海馬突觸可塑性的變化，進(jìn)而導(dǎo)致老化中學(xué)習(xí)記憶功能的下降。
　　4、睪丸切除分別給予不同劑量的長(zhǎng)時(shí)和短時(shí)雄激素替代后，GluR1、PSD-95均呈倒“

17、U”型表現(xiàn)，長(zhǎng)時(shí)雄激素替代后ERα表達(dá)無(wú)明顯變化、GPR30表達(dá)上升顯著，結(jié)合離體實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示雄激素劑量過(guò)大或替代時(shí)間延長(zhǎng)可能會(huì)有神經(jīng)毒性作用，導(dǎo)致突觸蛋白表達(dá)的障礙且其作用途徑之間會(huì)發(fā)生改變。
　　綜上可知，本研究運(yùn)用免疫組織化學(xué)技術(shù)(IHC)、Western blot等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，研究了睪丸切除后成年雄性小鼠腦內(nèi)海馬區(qū)GluR1、PSD-95、AR、ERα、ERβ、GPR30、SRC-1的表達(dá)變化以及AR、ERα、ERβ和SRC