丁苯酞對ALS模型小鼠雄激素受體表達(dá)的影響.pdf

1、目的:肌萎縮側(cè)索硬化（amotrophiclateralsclerosis，ALS）是神經(jīng)系統(tǒng)的變性疾病，緩慢起病，選擇性累及腦和脊髓中的運(yùn)動神經(jīng)元，表現(xiàn)為進(jìn)行性加重的肌肉無力、萎縮，其中90％以上病例為散發(fā)，10％左右為家族性[1]。其發(fā)病機(jī)制尚不清楚，一般認(rèn)為與谷氨酸毒性，氧化應(yīng)激，細(xì)胞骨架異常，軸漿運(yùn)輸障礙,神經(jīng)炎性反應(yīng)等多種病因相關(guān)。目前，除利魯唑可延緩其疾病進(jìn)展外，缺乏有效治療，迄今仍缺乏有效的治療方法。
　　 性激素

2、是指由動物的性腺，以及胎盤、腎上腺皮質(zhì)網(wǎng)狀帶等組織合成的甾體激素。雌性動物卵巢主要分泌兩種性激素，雌激素與孕激素，其中雌二醇的活性最強(qiáng)，雌二醇我們知道是最重要的雌激素，在神經(jīng)組織展示了很多不同的作用如神經(jīng)營養(yǎng)作用和神經(jīng)保護(hù)作用，雌酮及雌三醇為其代謝轉(zhuǎn)化物。雄性動物睪丸主要分泌以睪酮為主的雄激素。雄激素可以通過作用于雄激素的受體或通過芳香化酶轉(zhuǎn)化為雌激素起保護(hù)作用。這種轉(zhuǎn)化在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中已經(jīng)證明與腦的性分化有重要關(guān)系。神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病受

3、很多因素的影響如環(huán)境、遺傳、性別差異等，其中性別差異受到越來越多的重視。
　　 丁苯酞(dl-3n-butyphthalide，NBP)是我國心腦血管領(lǐng)域中第一個擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的新藥，從芹菜種籽中分離出的有效成分，相對分子質(zhì)量為190.24，具有多種神經(jīng)保護(hù)功能，可直接通過血-腦屏障，重構(gòu)缺血區(qū)微循環(huán)，保護(hù)線粒體免受損傷，改善能量代謝等。研究證實(shí)其可以明顯改善血管性癡呆患者的癥狀，提高其血清內(nèi)SOD的活性并降低MDA的含量，從

4、而減少氧化應(yīng)激。近來有研究認(rèn)為丁苯酞對神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病也有一定療效。
　　 本實(shí)驗通過觀察丁苯酞對家族性肌萎縮側(cè)索硬化模型hSOD1G93A轉(zhuǎn)基因鼠生存期和終末期各組小鼠脊髓前角運(yùn)動神經(jīng)元數(shù)目及脊髓前角雄激素受體的表達(dá)，旨在探討丁苯酞對hSOD1G93A轉(zhuǎn)基因鼠的作用及其神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。
　　 方法:
　　 1動物分組及給藥方法
　　 由B6SJL2BTg(SOD12G93A)1Gur/J半合子雄鼠和B6S

5、JLF1/J+/+雌鼠(購自美國JacksonLab)配種繁殖，SP級，經(jīng)PCR鑒定出hSOD1G93A陽性的小鼠48只，并隨機(jī)分為丁苯酞組，安慰劑組和空白對照組，選取同窩hSOD1G93A陰性小鼠作為陰性對照組，每組12只，雌雄各半。于小鼠42天起按照180mg/kg劑量的丁苯酞對丁苯酞組小鼠進(jìn)行灌胃，安慰劑組給予同等量(10ml/kg)的玉米油，同樣采用灌胃方法，一天一次?？瞻准瓣幮詫φ战M自由攝取水。
　　 2生存期的判定<

6、br>　　 將小鼠側(cè)臥位放置在平板上，如其在30秒內(nèi)不能翻身，判定為死亡，該天記錄為小鼠死亡時間，生存期為小鼠從出生到死亡的天數(shù)。
　　 3.1HE染色
　　 用10％水合氯醛將小鼠麻醉后，心臟灌注4％多聚甲醛固定20min，取小鼠脊髓腰段以4％多聚甲醛固定48h，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，常規(guī)組織切片。5μm厚的石蠟切片應(yīng)用HE染色，觀察脊髓前角神經(jīng)元存活情況。
　　 3.2免疫組化
　　

7、用10％水合氯醛將小鼠麻醉后，心臟灌注4％多聚甲醛固定20min，快速取出小鼠脊髓腰段以4％多聚甲醛固定48h，石蠟切片25μm厚，免疫組織化學(xué)法觀察髓前角運(yùn)動神經(jīng)元雄激素受體的表達(dá)分布。每只小鼠取5張切片，每張切片采集脊髓前角左右2個視野，200倍鏡下觀察，計數(shù)位于脊髓中央管后緣腹側(cè)的脊髓前角內(nèi)輪廓染色清晰的、直徑＞25μmm的神經(jīng)細(xì)胞，取單側(cè)脊髓前角運(yùn)動神經(jīng)元計數(shù)的平均值進(jìn)行統(tǒng)計。
　　 4統(tǒng)計學(xué)方法
　　 所有數(shù)據(jù)

8、應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，生存時間采用Kaplane-Meier(K-M)生存曲線進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料應(yīng)用(x)±s表示，生化指標(biāo)應(yīng)用ANOVA進(jìn)行方差分析。P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1生存期
　　 丁苯酞組生存期為135.25±2.111天，安慰劑組為124.833±1.492天，空白對照組生存期為122.579±1.373天，丁苯酞組與安慰劑組相比，P=0.000，丁苯酞

9、組與空白對照組相比，P=0.000，均具有統(tǒng)計學(xué)差異。其中丁苯酞組雄性hSOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠生存期為（139.00±2.573天）比雌性的hSOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠生存期（130.00±1.924天）長，P=0.000，具有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 2HE染色
　　 HE染色結(jié)果顯示，終末期，殘存運(yùn)動神經(jīng)元數(shù)量丁苯酞組為9.47±2.446，安慰劑組、空白對照組與陰性對照組分別為4.67±1.175、4.47±1.12

10、5、23.53±2.2，丁苯酞組與安慰劑組相比，P=0.000，與陰性對照組相比P=0.000，據(jù)有統(tǒng)計學(xué)差異。其中丁苯酞組雄性hSOD1,G93A轉(zhuǎn)基因小鼠殘存運(yùn)動神經(jīng)元數(shù)目為11.57±0.976，雌性hSOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠殘存神經(jīng)元數(shù)目為7.63±1.685，相比P=0.00，具有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 3免疫組化
　　 免疫組化結(jié)果顯示，丁苯酞治療組AR陽性的神經(jīng)元數(shù)量為5.87±1.598，安慰劑組、空白對照

11、組與陰性對照組分別為2.93±1.1、3.00±1.134、17.40±1.765。丁苯酞治療組與安慰劑相比，P=0.000，有統(tǒng)計學(xué)差異。其中丁苯酞組雄性hSOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠AR陽性的神經(jīng)元數(shù)目為6.75±1.282，雌性hSOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠AR陽性的神經(jīng)元數(shù)目為4.86±1.345，P=0.015，具有統(tǒng)計學(xué)差異。在丁苯酞治療組雄性轉(zhuǎn)基因小鼠脊髓前角神經(jīng)元內(nèi)可見雄激素受體表達(dá)較多，胞漿內(nèi)有較強(qiáng)的免疫著色，而在安慰劑組