神經(jīng)母細(xì)胞瘤中DKK3基因啟動(dòng)子甲基化及其表達(dá)失活的研究.pdf

1、背景與目的:
　　神經(jīng)母細(xì)胞瘤作為嬰幼兒中最常見的腫瘤，主要的發(fā)病年齡均在2歲以內(nèi)，部分患兒可由惡性轉(zhuǎn)化為分化成熟型，然而，目前關(guān)于神經(jīng)母細(xì)胞瘤的病因、發(fā)病機(jī)制尚未明確。現(xiàn)階段研究并未涉及某一抑癌基因DNA序列的的基因突變。DNA的甲基化是一個(gè)能夠發(fā)生逆轉(zhuǎn)的進(jìn)程，該我們應(yīng)用去相關(guān)的去甲基化藥物，可使這一進(jìn)程發(fā)生轉(zhuǎn)變，它能有效去除甲基化狀態(tài)的抑癌基因，使其啟動(dòng)子區(qū)域恢復(fù)其功能，這是它能夠抑制腫瘤生長的機(jī)理，其中我們所知的一些去甲基化

2、藥物有兩種，即5-氮雜胞甘和5-脫氧氮雜胞甘DKK3基因是Dickkopf家族的一員，研究顯示其作為一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的候選抑癌基因，它參與Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路，并在此通路中發(fā)揮拮抗作用，其具體的作用機(jī)制是結(jié)合Wnt受體復(fù)合體，失活Wnt信號(hào)通路，使之不能發(fā)揮作用,進(jìn)而沉默該拮抗基因，通路的抑制作用不存在，細(xì)胞發(fā)生惡性增殖，引發(fā)腫瘤。許多的報(bào)告指出DKK3基因在很多腫瘤發(fā)生變化，例如胃癌、食管癌、大腸癌，以及前列腺癌、乳腺癌等，它們或者缺失，或者

3、表達(dá)下調(diào)，在NB中DKK3基因啟動(dòng)子甲基化這項(xiàng)研究尚未有明確的報(bào)告，此次研究以介紹其轉(zhuǎn)錄表達(dá)狀況，同時(shí)還有5氮雜胞苷對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞NB-1細(xì)胞增殖及DKK3基因的影響，因此我們通過運(yùn)用甲基化聚合酶鏈反應(yīng)及半定量RT-PCR技術(shù)，分別檢測(cè)DKK3基因mRNA及該基因啟動(dòng)子在NB癌組織及配對(duì)的瘤旁組織TAC的表達(dá)狀況，分析它們與臨床病理特征及分期的關(guān)系，最后利用5-azaC干預(yù)神經(jīng)母細(xì)胞瘤NB-1細(xì)胞株，以初步探討DKK3基因在神經(jīng)母細(xì)

4、胞中表達(dá)失活的機(jī)制，5氮胞雜苷對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株生長增殖及其DKK3基因表達(dá)的影響，來判斷DKK3基因是否是神經(jīng)母細(xì)胞瘤的候選抑癌基因，這也使我們有了新的想法，它能否作為NB的相關(guān)基因，并且可以從中找到治療新的思路。
　　材料與方法
　　1.RT-PCR應(yīng)用于此，檢測(cè) DKK3基因從 RNA水平上在51例NB組織及TAC組織中的轉(zhuǎn)錄情況，甲基化聚合酶鏈反應(yīng)被應(yīng)用與此，從而來測(cè)定在NB組織以及癌旁組織中DKK3基因啟動(dòng)子的甲

5、基化情況，通過實(shí)驗(yàn)探討臨床上分期、分級(jí)的關(guān)系。
　　2.經(jīng)不同濃度、逐漸遞增的5-氮胞雜苷處理神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞后，MTT試驗(yàn)方法被應(yīng)用于此來觀察其對(duì)細(xì)胞生長的作用；對(duì)其基因及甲基化狀況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)處理：兩樣本率比較應(yīng)用四格表的X2檢驗(yàn)；嚴(yán)格遵守嚴(yán)密的統(tǒng)計(jì)學(xué)依據(jù)。
　　結(jié)果
　　1.癌旁組織和NB中其mRNA的表達(dá)率依次為100％，及43.1%，這充分說明2組差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(以P<

6、0.05為依據(jù))；從而我們可以知曉DKK3基因甲基化及其表達(dá)與患者的病理學(xué)分級(jí)有明顯相關(guān)性(P<0.05)。
　　2.DKK3基因啟動(dòng)子的甲基化在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)，與其mRNA表達(dá)呈現(xiàn)明顯的負(fù)相關(guān)性（P<0.05）
　　3.經(jīng)逐漸遞增的不同濃度去甲基化時(shí)間的延長和藥物濃度的增加，神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生長被藥物明顯抑制，準(zhǔn)確的說它的時(shí)間和劑量成依賴性關(guān)系以P<0.05為有效的統(tǒng)計(jì)學(xué)依據(jù)；經(jīng)不同濃度逐漸增高的藥物5氮胞雜苷處理

7、NB-1細(xì)胞后，DKK3基因的信使蛋白的相對(duì)表達(dá)量依次為0.201±0.014、0.351±0.011、0.468±0.015、0.599±0.009，表達(dá)強(qiáng)度與5-氮胞雜苷的藥物濃度呈劑量依賴關(guān)系（F=365.577，P<0.01）；通過MSP檢測(cè)得出結(jié)論，經(jīng)5氮胞雜苷處理后，原來存在的DKK3基因啟動(dòng)子的高甲基化區(qū)域，被部分去甲基化，這說明了其具有去甲基化的作用（Fm=295.342,Fum=189.148;P<0.05）。