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文檔簡介
1、γ-癸內(nèi)酯(gamma-decalaetone,GDL)是一種天然食品香料,隨著人們對這種安全的天然食品香料需求日益增加,本文嘗試通過基因敲除的手段敲除耶羅維亞酵母(Yarrowia lipolytica)基因組中的POX5基因,切斷代謝途徑中消耗γ-癸內(nèi)酯的一條支路,獲得POX5單倍體缺陷菌株,為工業(yè)生產(chǎn)中提高γ-癸內(nèi)酯產(chǎn)量和進行多基因缺失菌種改造奠定基礎。
文中使用Cre/loxP系統(tǒng)和KanMX(G418抗性)篩選標
2、記建立了酵母POX5基因的敲除方法。從NCBI網(wǎng)站上查到POX5基因和質(zhì)粒pUG6的序列信息,設計3對擴增引物以及4對驗證引物。其中合成敲除組件的擴增引物游5’末端由60個與POX5基因上下游同源的核苷酸序列組成;3’末端由20個和pUG6質(zhì)粒上的loxP位點同源的核苷酸序列。驗證引物A,D分別位于POX5基因的上下游;B,C位于kanMX標記基因內(nèi)。擴增引物通過擴增pUG6質(zhì)粒中的loxP-kanMX-loxP序列組件產(chǎn)生POX5基因
3、敲除序列組件。敲除組件轉化到耶氏酵母中后與POX5基因序列上下游同源的60bp序列發(fā)生同源重組,最終以loxP-kanMX-loxP取代基因組中的POX5基因并賦予轉化子G418抗性。多種PCR方法反復驗證為正確的陽性克隆子后,進一步轉化攜帶可賦予Zeocin抗性的質(zhì)粒pSH65,并在含半乳糖的培養(yǎng)基中誘導質(zhì)粒pSH65表達Cre重組酶,此酶的表達可以切除兩個loxP位點間的kanMX標記基因,導致成功切除KanMX的菌株會失去G418
4、抗性。
PCR檢驗中不僅發(fā)現(xiàn)了POX5單倍體缺陷型菌株,而且發(fā)現(xiàn)了有部分耶氏酵母菌突變?yōu)槎扼w,將突變菌在適宜的McClary產(chǎn)孢培養(yǎng)基上誘導二倍體產(chǎn)孢,用2%的蝸牛酶將子囊壁破裂,釋放孢子,篩選成功缺失POX5基因的單倍體耶氏酵母菌。成功菌傳代培養(yǎng),誘導質(zhì)粒pSH65丟失,最終得到POX5單倍體缺陷型菌株。
成功菌株經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后,氣相色譜法測定發(fā)酵液中GDL含量。與原始耶氏酵母菌比較,耶羅維亞酵母POX5單
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